常用分子生物学技术教案.DOCVIP

教 案 姓名 顾洪雁 　 2012 ～2013 学年第 学期 时间 节次__ 课程名称 分子生物学 授课专业及层次 授课内容 第六章 常用分子生物学技术 学时数 4学时 教学目的 掌握常用分子生物学技术的概念及基本原理；熟悉常用分子生物学的基本方法；了解常用分子生物学技术研究进展以及在药学领域的应用。 重点难点 讲授内容纲要、要求及时间分配 第六章 常用分子生物学技术 第一节 分子杂交技术 分子杂交技术是利用单链核酸碱基互补配对、抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行目的核酸、蛋白质检测，广泛应用于基因重组、生物印迹示踪，生物芯片等领域。 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 southern 印迹 DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。 （一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 （二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶，分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带 （三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 （四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的 （五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点，预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交，双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA （六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 Northern 印迹 Northern印迹杂交: RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。Northern印迹杂交常用于检测组织或细胞的基因表达水平。 （一）基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 （二）变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性;不能用碱变性，防止水解。用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛变性。　　 （三）转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 （四）靶核酸为RNA （五）探针可用DNA或RNA片段 Western印迹 Western印迹，也称Western免疫印迹（WesternBlot或WesternBlotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至到固相载体上，然后用抗体通过免疫学反应检测目的蛋白，分析基因的表达程度。 原位杂交 概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或 RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。 生物芯片 生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支 持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。 芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号即可实现对生物样品的分析。 分类：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、元件型微阵列、通道型微阵列、生物传感芯片 第二节 目的基因制备技术 PCR 1. 掌握PCR技术的基本原理2. PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。 3. PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 CDNA文库 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 化学合成 按照氨基酸的排列顺序，推知核酸的核苷酸