MTT实验方法步骤.docVIP

一．悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1×109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。收集对数生长期的UMR106细胞，调整细胞浓度至1×108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。每孔取100μl的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20μl，培养4h，再加入10％SDS100μl，测定570nm处的A值。计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412～ 416SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。除此之外SRB法还有以下优点：　(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。要用MTT法，可以选用无酚红的无色培养基，离心吸取部分上清，不要吸走底部细胞和formazan,剩下部分放烤箱烘干。就不会影响你的测定了。悬浮肿瘤细胞MTT法检测细胞生长抑制率时采用的细胞裂解液配方及如何配制细胞种于96孔板中，6小时左右后，加入受试药物,继续培养72小时后加入20 ul 5mg/ml的MTT，37温育4小时，加入100 ul三联液（10％SDS－5％异丙醇－12mMHCl），温育12－20小时，用平板读数计在570nm处测定每孔的光密度值（OD值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算检测悬浮细胞生长抑制率用CCK-8试剂比较好，操作比较简单，误差比较小。悬浮细胞ｍｔｔ，何时加药物？细胞接种９６孔板时？一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。 但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁 以前就要加药了。贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板， 太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了， 太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高， 让试验时落在对数早中期最好一种方法加MTT， 孵育，离心，去上清，每孔加入DMSO。振荡10分钟后选择波长，测OD值；这种方法较麻烦，尤其是没有平板离心机的情况下。另一种方法是酸化异丙醇法：细胞悬液离心，弃上清，加MTT，孵育，加入酸化异丙醇，离心，取上清测OD值。后者推荐使用。悬浮细胞可以用EP 管离心，但是，一般悬浮细胞是养在培养板里的，如果你再把悬浮细胞转到EP管里，再离心，会很累的。最好用平板离心机离心，如果没有，只能转到EP管里再离了。但是，转来转去的，会丢失细胞不说，还有可能影响到细胞的活力。DMSO和酸化异丙醇原理应当差不多，活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲赞,后者溶于有机溶剂（二甲基亚枫、酸化异丙醇）,甲赞产量与细胞活性成正比。可用酶标仪测定其OD值。异丙醇中加入HCl配成0.04mol/L。不同的时间加入不同的药物，你可以使用可拆式细胞培养板呀。一般实验你要做几个复孔的，所以，一个板子，有的时候显得还不够用呢。你还可以用二十四孔板，六孔板呀。多买几个板子，同时培养，但是在不同的时间处理。比如二十四小时的时候拿出一个来做MTT。再过二十四小时