免疫组化ICH课件.pptVIP

免疫组织化学及其应用 概 述 1．免疫组织化学概念 免疫组织化学(Immunohistochemistry) 又称免疫细胞化学，其主要原理是用荧光素、酶、胶体金等标记的抗体检测细胞或组织内的相应抗原，经过组织化学的呈色反应之后，用光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察，进行定性、定位或定量分析。 通过免疫组织化学手段，凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其检出和对其进行研究。 2．免疫组织化学的相关理论和技术 2.1 免疫组织化学的工作原理 抗体与其抗原特异性结合 通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定位和含量。 2.2 免疫组织化学的全过程包括： 　　① 抗原提取和纯化 　　② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体） 　　③ 抗体效价检测和抗体纯化 　　④ 标记抗体 　　⑤ 细胞和组织切片标本的制备 　　⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 　　⑦ 观察和记录结果 抗体(antibody) 多克隆抗体(polyclonal antibody) 纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。 单克隆抗体(monoclonal antibody) 单克隆抗体是由一个B淋巴细胞克隆分泌的针对一种抗原决定簇的抗体。 大多数为小鼠Ig。其优点为特异性强、抗体产量高。但灵敏度逊于多抗。 单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇（这一抗原决定簇可以是抗原分子上的无关抗原决定簇）。 在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。 2.3 免疫组织化学组织细胞处理 切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁： 市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2 h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）： 干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+ 50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。 石蜡组织切片中抗原性的修复： A、化学方法： 胰蛋白酶（0.05～0.1% ，含0.1%CaCl2） 蛋白酶K B、物理方法 单纯加热法： 高压加热法： 微波方法： 柠檬酸盐缓冲液 2.4 常用免疫组织化学方法： A、一步法 B、二步法 C、三步法 D、多步法 一、免疫荧光法 用荧光染料作为标记物，最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)。将FITC标记的特异性抗体和组织切片上的相应抗原结合，在荧光显微镜下观察，FITC呈现黄绿色荧光，代表所鉴定抗原的定位。FITC为黄褐色粉末或结晶，最大吸收波长为490nm，最大发射波长为520nm。 免疫荧光法分为直接法和间接法（二步法）。 二、免疫酶法 用酶标记抗体，在组织切片上进行特异的抗原抗体反应后，用组织化学方法使标记的酶催化相应的底物，生成有色产物，在显微镜下观察，可间接地对抗原物质进行定位。标记抗体常用的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等，以辣根过氧化物酶作为标记物更常用。 常用的免疫酶（染色）方法 免疫酶标法 PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联接，最后用底物显色剂显色。 非酶标法：PAP法 抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象） 亲和免疫组化 葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素－生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex, ABC) ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。用生物