免疫组化技术常见问题及处理方法课件.ppt

高压锅热抗原修复 比微波更有效 能处理大批量的切片 达到更高的温度 加热均匀（不像微波炉有热点和冷点）和节省时间 高压锅热抗原修复 将高压锅中的缓冲液煮开（不加盖） 将切片放入沸腾的缓冲液 盖紧盖子和高压阀，加热至全压力 达到全压力后才能计时，最佳时间由各个实验室自行确定----通常在2-4分钟 热抗原修复：注意事项 无论哪一步都不要让切片干涸（抗原可完全丢失） 加热后需要冷却15～30分钟（个别未折叠的蛋白链恢复到原来的构型） 热抗原修复存在的问题 过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消化，免疫染色变弱或定位不准确 有一个时间点，超过这个时间点进一步热修复也不会获得更强的染色效果 解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验 修复过度的实验组 修复过度的实验组 修复过度的对照组 修复过度的对照组 酶消化修复 缩短修复时间 热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用卵白素抗生物素系统会产生假阳性 　　富含内源性生物素的组织： 　　 — 肝细胞 　 — 线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等 　　 — 胞浆丰富的肿瘤细胞 热抗原修复的问题：内源性生物素 组织在热修复之后，用3％的新鲜H2O2进行封闭， 以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min，再用10％鸡（鸭）蛋清阻断10～15分钟，清洗后滴加一抗 应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统 阻断内源性生物素的方法 热抗原修复的缓冲液 pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修复液等 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好 推荐使用：EDTA缓冲液 pH 8.0或Tris-EDTA缓冲液pH 9.0 是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体 抗体孵育条件 主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成反比的（相对） 浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度，时间决定反应的量 温度有 4 度、室温、37度，其中4 度最佳，反应最温和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间较短；室温不太提倡 4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min 复温的必要性 防止切片从4度直接放入PBS易脱片 使抗原抗体结合更稳定 4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色 免疫组化技术常见问题及处理方法 免疫组织化学的定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 免疫组织化学的原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光素等的二抗进行反应 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量 免疫组织化学的分类 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、荧光标记和放射性标记等 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多 可被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测 免疫组织化学的特点 1）特异性强 2）敏感性高 3）定位准确、形态与功能相结合 Western blotting、ELISA与免疫组化的异同 Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位，但敏感性远远低于免疫组化技术 ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一 免疫组织化学方法的基本步骤 组织和细胞的处理 抗原修复 染色 鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清） 鼠单克隆抗体 特异性较高 背景较干净 有多种潜在用途 但敏感性、亲和力低 兔多克隆抗体（兔抗血清） 高敏感性、亲和力 可能有较多的交叉反应 更多的潜在用途 SP法 1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(