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印迹法（Blotting）技术简介 李娟 马晓伟 oct18,2010 定义： 印迹法（Blotting） 是指将样品转移到固相载体上，然后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Southern blotting 1975年，Edward M. Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法 Northern blotting 1979年，McMaster和Carmichael对RNA进行印迹分析，发明 Northern印迹技术 Western blotting 1979年，George Stark对电泳后的蛋白质分子进行印迹分析从而 发明western印迹技术 概述 生物大分子印迹法实际上是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶电泳已分离的区带转移并印迹于固定化膜上。 蛋白质分析中应用的Western杂交方法与DNA分析应用中的Southern杂交法RNA分析中的Northern杂交法相似，均是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体上，并均以针对特定氨基酸或核苷酸序列所制备的特异性样品作为探针检测其相同或相似序列。 Southern Blotting DNA提取 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 Northern Blotting RNA提取 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色 Western Blotting 操作流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色 使用的仪器 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳 迁移率主要依据其分子量和电荷的差异及形状等因素 2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 迁移率主要依赖于蛋白质大小 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： ? SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构 ? SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的条带带也为蛋白质的亚基 SDS分离胶配方 SDS浓缩胶配方 电泳 上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶。 电泳时，应采用恒压的模 式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。 一般采用恒压浓缩胶80V，30min分离胶110V 时间视所要检测的蛋白分子量及胶浓度而定。 转膜后检测 丽春红染色 丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带，丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用PBS或TBS-T溶液洗去 封闭 脱脂奶粉（5％） BSA（牛血清白蛋白） Western Blotting 膜封闭液 洗转印膜：室温用TBS-T漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。 2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min. 一抗、二抗孵育 1. 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据抗体效价选择合适的抗体浓度，将一抗溶液与滤膜温育。室温6小时左右，4℃过夜 2. 倒掉一抗溶液，用TBS-T漂洗液滤膜3次，每次7min 3. 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温2小时 4. 倒掉二抗溶液，用TBS-T漂洗液滤膜3次，每次7min,即可准备显影 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 将在暗室中将显色剂A,B 溶液按1：1混合，后均匀涂抹在膜上结合有二抗的地方即可催化底物发出荧光 将胶片贴在膜的发光区上，根据荧光强弱选择合适的曝光时间 曝光结束后将胶片放入显影液中至出现条带后再放入定影液中 转膜：膜的选择，转膜方法取舍 样品处理 Western blotting 常见问题分析及其应用