酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类一类由-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.15.2.30 酶的分离纯化方法简介 生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的 酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶， 就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另 一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内 酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种 酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布 区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。 酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一 种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却 差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料， 如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内 脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目 前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶 制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微 生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量， 用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶 和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应 避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化 活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选 择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始 终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度 提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将 所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从 中国试剂网 3.15.2.30 溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的 酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption ） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲 霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转 到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在 12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90% 以上的细胞破碎率，起码 要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道， 当操作压力达到175Mpa 时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa 时，细胞破 碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会 堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养 基上生长的大肠菌更难破碎。 容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具 体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5% 的氯化钠溶液 中，使细胞浓度为5% （干重），在35℃用0.68kg （干重）的蛋清处理20min ， 得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除 去，再将乙醇浓度提高到 75% （体积分数），可以得到纯度为 5%的过氧化氢酶 1500g。 2.离心 离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3 种类型，所使用的设 备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔， 壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉 降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或 有机溶剂处理过的蛋