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实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测 综合性实验 前言（含目的及原理） 各种天然水中常含有一定数量的微生物。 水生性微生物(如光合藻类) 土壤、空气微生物 动物尸体及分泌物微生物 生活污水中微生物微生物 水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。 1、前言（含目的及原理） 水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。 粪便污染指示菌的理想条件是： 人畜粪便中的正常菌，且数量较粪便中其他菌多； 受人畜粪便污染的环境中可检出，而在未受污染环境中无该菌存在； 排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长； 对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病菌 检出与鉴定方法比较简单。 人畜肠道大肠菌群的可以满足上述理想条件。 1、前言（含目的及原理） 国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。 我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85 细菌总数1ml水中不超过100个 大肠杆菌数1 L 水中不超过3个。 若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水,大肠菌群数平均每升不得超过1000个 经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水,大肠菌群数平均每升不得超过10000个 大肠菌群的检测——多管发酵法 特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。 多管发酵法 初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气； 分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落； 复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。 本实验的目的 了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。 学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。 学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 2、材料与方法 2.1 实验材料、仪器、试剂 材料：自选（自来水、公园湖水、河水） 仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环 、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。 试剂 ： 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂 2、材料与方法 2.2 培养基的配制 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定 牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g， 蒸馏水1000ml； pH 7.0 乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵 1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水 1000mL、pH 7.2－7.4 三倍浓缩液（3×）：除水以外，其余成分取三倍用量。 分装：1×的培养基分装9ml/管， 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。 灭菌条件：115℃ ，15min。 EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定 脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。 2、材料与方法 2.3 水样的采集 自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。(500ml采样瓶加15g/L硫代硫酸钠溶液1.5ml) 公园湖水、河水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。 如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存，6h以内使用。 2、材料与方法 2.4细菌总数的测定 1)按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释，保证30~300菌落/平皿 生活饮用水（自来水、深井水）：100、10-1两浓度； 水源水（ 河水）等： 10-1、 10-2、 10-3、 污水：10-2、 10-3、 10-4 2）选择3个适宜稀释度，吸取1 mL于无菌培养皿，加入冷却至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15ml，立即混匀，静置使培养基凝固。每个稀释度作2个重复。 3）将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。 2、材料与方法 2.4 多管发酵法测大肠菌群 自来水 1）初发酵实验 100mL水样两份：分别以无菌操作加入两个装有已灭菌的50mL 的3×浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液烧瓶中（内有倒置小管），充分混匀； 10mL水样10份：分别以无菌操作加入各装有5mL的3×乳糖胆盐蛋白胨的发酵试管中(内有倒置小管)，混匀； 以上材料置于37℃恒温箱内培养24h。 2）平板分离：上述各发酵