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Wnt蛋白检测原理 一：概述 1、WNT是一类广泛存在的分泌型糖蛋白。在动物的生长发育过程中，对细胞的增殖、分化和迁移起巨大的调节作用，决定细胞的极性、命运、前体细胞的增殖、体轴的建立，以及细胞的不对称分裂等，在成人以后，则主要参与机体内平衡稳定。目前已知的主要有19种WNT蛋白,其中激活经典通路的有WNT-1,WNT-3a和WNT-8 . 2、在胚胎发育过程和中枢神经系统形成中wnt信号通路具有重要的作用，调节着细胞生长、迁移以及分化。当体内的wnt通路失活会导致一些肿瘤癌症的发生，如果加入外源性的wnt蛋白可以激活wnt信号通路。 我们使用的是果蝇的的S2(果蝇胚胎细胞) 细胞，可以通过培养获得分泌的WNT3a蛋白，因此需要检测wnt蛋白的活性。 一：检测用细胞L S/L细胞 L S/L细胞是小鼠的成纤维细胞这种细胞里已经转入了TOPFlash 质粒载体。TOPFlash reporter 最早是由Hans Clevers实验室构建，上面包括转录因子TCF/LEF 的结合位点，这个位点控制着荧光素酶报告基因的表达，但受β-catenin 转录活性调控 。 1、 luciferase L S/L细胞质中游离大量的β-catenin蛋白，易与细胞内的降解复合体形成复合物，被蛋白酶泛化，最后被降解。 存在Wnt蛋白时，降解复合体活性受到抑制，不与β-catenin结合， β-catenin不被降解，稳定后的β-catenin 将进入细胞核，特异性地活化转录因子TCF/L EF，激活Wnt 信号下游特异靶基因的表达 (也就是荧光素酶的表达）。 所以荧光素酶的表达量跟wnt蛋白的量称正比 Buffer AB（Galacton-plus），作为luciferase 的底物，发生下列生物荧光反应，产生有颜色的物质，通过荧光扫描，读出OD值A。 2、β— galactosidase L S/L细胞中除了转入了TOPFlash 质粒载体，还转入了LacZ基因，该基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，能够翻译表达出β— galactosidase。 AcCeLeratorⅡ试剂作为β— galactosidase 的底物发生反应，产生有颜色的物质，通过荧光扫描，读出OD值B 所以β— galactosidase 的含量跟L S/L 的数量成正比。 理论上每个孔的LS/L细胞的数量是50000个但是实际上稀释加入时每空的细胞量有不同，所以OD值A/B处理下来是单位细胞对wnt蛋白的反映，再除以空白孔测定下来的OD值C，得出比活，有利于每批wnt蛋白含量高低的平行比较。 * * TOPFLASH