第04章：-免疫组化技术-1.ppt

（二）非酶标记抗体染色法 由于酶标抗体法中酶与抗体之间的共价键结合能损害部分抗体和酶的活性，抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织结合可导致背景染色等。1969年Masson建立了非酶标桥抗体法（bridge antibody method），1970年Sternberger创建了辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶法（peroxidase anti-peroxidase method，PAP）。 1．桥抗体法 首先制备高效价的特异性抗酶（HRP）抗体（三抗），然后利用二抗作为“桥梁”，将抗酶抗体连接在与组织待测抗原结合的一抗上，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色后显示抗原的存在。具有二次放大作用，比间接法更为敏感，但操作步骤复杂。制备三抗和二抗的动物必须与一抗为同一种动物，以保证其相互结合。二抗的一个Fab片断与一抗的Fc段结合，另一个Fab片断与三抗的Fc段结合，二抗作为连接一抗和三抗的“桥梁”，故称为桥抗体。当三抗与二抗结合后，再加HRP，此时HRP即可与三抗自然结合，从而形成一个复杂的抗原-一抗-二抗-三抗-HRP复合物而显色 2．间接法 间接法不需直接标记特异抗体(一抗），而是标记第二或第三抗体。 （1）夹心法：先用特异性抗原与组织内的抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在组织内抗体上的抗原结合，抗原夹在组织抗体与荧光抗体之间，故称为夹心法。 （2）检测抗体法：用已知抗原的组织切片，加上 待测血清，其中的特异性抗体与切片中的已知抗原结 合，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体） 与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体 必须用抗人IgG荧光抗体）。在荧光显微镜下就可以 见到抗原抗体反应部位呈现特异性荧光。此法是常规检测血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。 （3）检测抗原法：先用特异性抗体与标本中的待测抗原反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（二抗）与结合在抗原上的一抗结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物。本法只需要制备一种种属间荧光抗体，不但简便快速，而且特异性强、敏感性高。 3．补体法 （1）直接检测组织内免疫复合物：用抗补体C3等荧光抗体直接作用于组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物，在抗原-抗体-补体复合物存在的部位呈现特异性荧光。 （2）间接检测组织内抗原：将新鲜补体与一抗混合，同时加在抗原标本上，37℃孵育后如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-抗体-补体-荧光抗体复合物。 利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光 四、常用荧光染色方法 1．直接法 (1）向切片滴加最佳效价的荧光标记一抗，室温或37℃避光作用30min； （2）倾去残留的荧光一抗，浸入PBS(pH7.2~7.4)，电磁振动，洗涤5min×2次； （3）蒸馏水洗涤1min除去盐结晶； （4）用50%缓冲甘油封固（0.5mol/L碳酸缓冲液， pH9.0~9.5），荧光显微镜观察。 （5）对照实验： 1）抗体对照：用正常血清代替荧光抗体血清，如上述方法处理，结果应为阴性； 2）抗原对照：类属抗原染色，结果应为阳性； 2．间接法 （1）向切片滴加最佳效价的一抗，室温或37℃避光作用30min； （2）倾去残留的一抗，用0.1mol/L PBS（pH7.2）洗涤10min×2次，吸去残留液体； （3）滴加间接荧光抗体，室温或37℃避光作用30min，PBS振动洗涤10min×2次； （4）50%缓冲甘油封固（0.5mol/L碳酸缓冲液， pH9.0~9.5），荧光显微镜观察。 （5）对照实验： 1）抗体对照：用正常血清代替一抗血清，如上述方法处理，结果应为阴性； 2）阳性对照：用阳性对照切片染色，如上述方法处理，结果应为阳性。 3．补体法 （1）将固定切片（涂片）0.1mol/L PBS（pH7.2）洗涤3min，吹干至表面无水分； （2）滴加最佳效价免疫血清和补体的等量混合液，室温或37℃避光作用30min；