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1.学习细菌接种与培养技术。 2．学会无菌操作技术，为细菌鉴定、控制等技能奠定基础。 实训四 细菌培养技术 -细菌接种与培养技术 一、实训目的 纯种分离：将待分离的细菌标本进行适当的稀释，使细菌细胞尽量呈分散状态，从而生长形成单个菌落。再将单个菌落移种至合适的培养基中，经培养可得到大量纯种细菌。 二、实训原理 1．试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。 2．器材：三角瓶、试管、量筒、吸管、电磁炉或电炉、手提式高压灭菌锅、天平、报纸或牛皮纸、白线绳、pH试纸等。 4.分组：每组4人，共12组 三、实训材料与设备 内容 液体 斜面 半固体 平板 数量 4支试管 4支试管 4支试管 8块平皿 所需体积 20ml 20ml 20ml 160ml 总体积 250ml 1．常用接种工具的使用 （1）接种针：用镍铬合金或白金丝制成，长5-7cm，一端固定在约20cm的铝制杆上，铝制杆的另一端套有隔热绝缘柄。主要用于半固体培养基穿刺接种和液体培养基接种。 （2）接种环：是镍铬合金或白金丝的前端弯曲成3-4mm密闭环状。主要用于固体平板和斜面划线接种，以及液体培养基接种。 四、实训步骤 （一）细菌接种技术 （1）在无菌室、超净工作台或接种罩内进行。 （2）无菌室、超净工作台、接种罩在使用前后需要用消毒液擦拭，再用紫外线灯照射消毒。 （3）所有器具、培养基等均需严格灭菌，使用过程中不能与外界未经消毒的物品接触，切忌长时间暴露在空气中。 （4）无菌试管、烧瓶等容器在开塞之后及塞回之前，口部均须在火焰上通过2-3次，以杀死可能附着于管口、瓶口的细菌或可能从空气中落入的杂菌。 （5）接种环（针）每次使用前后，均应在火焰上彻底烧灼灭菌，金属棒部分亦须通过火焰灭菌。 （6）操作完毕，应消毒剂洗手，再用自来水冲洗。 2．无菌操作技术 1）连续划线法：适用于含菌量较少的细菌标本。用已烧灼灭菌的接种环沾取适量标本，于平板培养基表面做“Z”字形连续划线，逐渐向下延伸直至划完整个平板表面。 常用平板划线法： 2）分区划线法：将平板培养基分成4（或5）个区域进行划线。此法适用于含菌量较多的标本。用接种环沾取少许细菌标本在平板培养基表面一角，以“Z”字形不重叠连续划线作为第一区，其范围不超过平板的1/4；然后将接种环烧灼灭菌，冷却后于第二区再作连续划线，在开始划线时与第一区的划线相交数次；完成后将接种环烧灼灭菌，继续按上述方法，分区划出第三、四区。 （2）液体培养基接种法：右手持接种环（或接种针），烧灼后冷却，左手握持菌种管和液体培养基管；以右手掌心与小指、小指与无名指分别夹取棉塞，将试管口迅速通过火焰灭菌；用已灭菌的接种环沾取菌种，迅速将菌种伸进倾斜的液体培养基管内，在接近液面的管壁上轻轻研磨；取出接种环并在火焰中烧灼灭菌，两试管口通过火焰灭菌后，将棉塞分别塞于原试管。直立试管，菌种即混合于液体培养基中。 （3）斜面培养基接种法：用于细菌纯培养或菌种保存。方法与液体接种法相似：左手握持斜面培养基时，应将其斜面朝上。管口经火焰灭菌后，将已沾取菌种的接种环（或接种针）伸进管内，先从斜面的底部轻轻划一直线至顶端，然后再从底部划“Z”形线至顶端；或先从斜面正中垂直刺入底部，再抽出在斜面划“Z”形线至顶端。 （4）穿刺接种法：适用于半固体培养基接种。方法：用接种针取菌种，从培养基表面正中垂直刺入至接近但不能达到管底，然后原路抽出。 （5）倾注平皿法：可用于饮用水、药物等检品的微生物数量测定。方法：取经适当稀释的检品1ml置于无菌培养皿中，再注入冷却至50℃左右的琼脂培养基15-20ml，混匀，静置待其凝固后放培养箱内培养至规定时间，作菌落计数，即可计算出检品中微生物的数量。