植物细胞DNA提取与PCR实验的设计及其关键参数的优选.pdf

2010年 4月 皖 西 学 院学 报 Apr．，2010 第26卷第 2期 JournalofWestAnhuiUniversity Vo1．26 N()．2 闵运 江 (皖西学院化学与生命科学系，安徽 六安 237012) 摘 要：以草本类型的蓼科 5种植物为实验材料 ，研究了DNA提取方法。探讨 了nrDNAITS片段的PCR扩增方法，通过 正交试验法，对该实验的关键步骤中PCR体系主要成分的最适含量进行 了优化。为植物细胞 DNA提取和PCR扩增这一现代 生物学必不可少的实验教学和相关科学研究提供方法借鉴。 关键词：DNA提取；PCR扩增；实验设计；正交试验；草本植物 中图分类号：Q94—33 文献标识码：A 文章编号：1oO9—9735(2O1O)O2一O089—04 植物细胞DNA的提取与扩增实验是生物学等 参照已发表的相关文献资料__1 5]以改良CTAB 相关 专 业 本科 生 必 需 掌 握 的 实 验 技 能之 (CetyltrimethyleAmmonium Bromide，十六烷基三 一 [] 卜。 [。] 。 [3--4] ，属于综合性、设计性实验。 甲基溴化铵)法，DNA提取与PCR扩增 nrDNAITS 植物细胞DNA的提取与扩增技术又是以上专业学 片段步骤如下： 生进一步进入研究生学习阶段必备的而又较难掌握 (1)改 良CTAB法提取DNA 的实验技能之一。 称取干样品1O～20mg一放入研钵中一加 1．5角 DNA分子双螺旋结构的发现以及 PCR(多聚酶 匙60~80目(AR)的石英砂一加适量液氮一研磨成 链式反应，polymerasechainreaction)技术的建立，分 粉末一将材料转入 2ml离心管中一加4xCTAB液 子生物学得到了迅猛的发展，并已渗透到生物学的各 9OO肚l一强烈振荡混匀一置 65~C水浴保温 60～ 门学科领域，已成为生物学各学科中发展速度最快， 90min，每 10min振荡一次一吸取上清液及部分样品 当今最热门的研究领域之一[ ][]。 浆液 (除去石英砂)一转人 1．5ml离心管中一加 DNA提取和PCR扩增操作是研究许多生物学 600~1氯仿：异戊醇一24：1的溶液一强烈振荡一 问题必不可少的实验环节，而大多数学生和研究者常 1200。r／min离心 10min-~取上清液一重复一次 (即： 常在此环节伤透脑筋。随实验材料的种类、材料保 再次加 600g124：1的氯仿：异戊醇一强烈振荡混匀一 存、运输条件的差异，以及实验操作过程的繁杂的实 离心)一取上清液一加异丙醇 450tA(上下移动 30S 验条件的改变，其中任何一个参数设置或控制不好， 轻摇)一在--20℃(或4~C)冰箱保存 15~30min(材料 结果就会导致实验的失败——无扩增产物或产物不 不好可为4～6h或过夜)一12O0。r／min离心5min一 理想，无法测序。 此时，应看到离心管底部有 白色沉淀一将此沉淀用 因此，本文以草本类型的蓼科 5种植物为例，对 75 乙醇洗涤 1～2次，倾去乙醇一在 37℃恒温金属 其进行 DNA提取、PCR扩增 nrDNA 的 ITS片段 浴上风干一加 50~lddH O(无菌超纯水)溶解沉淀一 (核糖体基因的间隔区ITS1和 ITS2，包含 5．8S基 加 2gl的RNA酶(50mg／~1)一37℃水浴 30min~ll 因)等实验进行设计，实验中的关键步骤的参数，通过 5~10gl的3M 的N