酶活力的测定方法.ppt

酶活的测定方法 目录 一、纤维素酶活的测定 二、a-淀粉酶活的测定 三、蛋白酶活的测定 四、DNS试剂的相关介绍 一、纤维素酶活的测定 二、a-淀粉酶活的测定 A.2.1 试剂和溶液 A.2.1.1 原碘液 称取碘11g、碘化钾（KI）22g,用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL,贮于棕色瓶中。 A.2.1.2 稀碘液 吸取原碘液（A.2.1.1）2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL,贮于棕色瓶中。 A.2.1.3 20g/L可溶性淀粉溶液，称取可溶性淀粉（以决干计）1.000g,精确至0.001g,用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水中，然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。此溶液需要当天配制。 A.2.1.4 磷酸缓冲液（PH=6.0） 称取磷酸氢二钠 45.23g,柠檬酸8.07g,用水溶解并定容至1000mL, 配 好后用PH校正。 A.2.2 仪器设备 A.2.2.1 分光光度计 A.2.2.2 恒温水浴 60℃±0.2℃ A.2.2.3 试管 25mm×200mm A.2.3 标准曲线的绘制 A.2.3.1 可溶性淀粉标准溶液，按表A2配制。 A.2.3.2 分别取上述溶液各1.0mL(须做平行试验)，加入到5mL稀碘液中，摇匀，于660nm测定吸光度，以不含可溶性淀粉的0管为空白对照。以吸光度为纵坐标，可溶性淀粉的浓度为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。 根据作图或用回归方程，计算出吸光度为1时可以、可溶性淀粉的量（mg）,即为吸光度常数K值，其值应在0.95～1.00范围。 A.2.3.3 原样酶液的制备 称取样品10.0g(或10.0mL),加入装有玻璃珠的三角瓶（150mL）中，在加入一定体积的磷酸缓冲液溶解，200r/min摇床振荡30min,然后四层纱布过滤，滤液再于3000r/min离心20min.离心后的上清液根据酶活力用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用。 A.2.4 测定步骤 A2.4.1 吸取可溶性淀粉（A.2.1.2)10mL于试（A.2.2.3）中，加入缓冲液（A.2.1.3）5.0mL，摇匀后，于60℃±0.2℃恒温水浴锅中预热5min. A.2.4.2 加入稀释好的待测酶液（A.2.3.3）1.00mL,立刻计时，摇匀，准确反应30min. A.2.4.3 立即吸取反应液（A.2.4.2 ）1.00mL于稀碘液（A.2.1.2 ）1.00mL中，摇匀，并以稀碘液做空白，于600nm波长下，用10mm比色皿，迅速测定其吸光度（A)。 A.2.5 计算 结果按式（A.2）计算： X=(4.76-A×K) ×21×n/30 ……………(A.2) 式中： X－ 样品的酶活力，单位为酶活力单位每克（毫升）【u/g(mL)】； 4.76－ 1mL反应液中最初含有的可溶性淀粉的量，单位为毫克（mg）； A－ 样品平行试验的平均吸光度； K－ 吸光常数； 21－ 反应液的总体积，单位为毫升（Ml)； n－ 稀释倍数； 30－ 反应时间，30min. 1g(mL)样品，于60℃、ph=6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u/g(mL）表示。 三、蛋白酶活的测定 四、DNS试剂的相关介绍 A.4.1 DNS试剂的相关介绍： 　　酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.03g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100ml，贮于棕色瓶中，室温保存. 　　但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。 A.4.2 DNS试剂配制标准 A.4.2.1 Ghose法 DNS试剂的配制 　　甲液：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。 　　 乙液：将255 g酒石酸钾钠溶于300 mL10%NaOH溶液中，再加入880 mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。 　　将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7-10 d后使用。在棕色瓶内保存一年有效。 A.4.2.2 轻工业部标准DNS试剂的配制 　　称取3，5—二硝基水杨酸(10土0.1) g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50 ℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g