重组基因向受体细胞导入与重组子的筛选.ppt

1.3 利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择性标记基因通常成为报告基因(reporter gene)，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，可从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。 常用的报告基因有新霉素磷酸转移酶II(NPT-II)基因，潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因，β-葡萄糖苷酶（GUS）基因和荧光素基因(LUC)等。 1.4 利用遗传选择标记 筛选哺乳动物转基因细胞 常用的遗传选择标记有新霉素磷酸转移酶II (NPT-II)基因，胸苷激酶基因(tk)、二氢叶酸还原酶基因(dhfr)等。 1.5利用噬菌斑形成筛选 对于λ噬菌体载体系统而言，外源DNA插入后，重组DNA分子必须在野生型λDNA长度78-105%范围内，才能在体外包装成具有感染活性的颗粒，转染受体菌后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长，二者很容易区分。 如果在重组过程中使用的是取代型λ载体，则噬菌斑中的λ噬菌体即为重组子，因为空载的λDNA不能被包装，不能进入受体细胞产生噬菌斑；如果在重组过程中使用的是插入型λ载体，由于空载的λDNA大于包装的下限，所以也能被包装形成噬菌体颗粒并产生噬菌斑，此时筛选重组子可以利用λ载体上的筛选标记基因，如lacZ’等。 1.6 利用插入序列提供的表型特征筛选 这种方法要求所克隆的DNA片段是一个完整的基因序列，而且能够在大肠杆菌中实现功能性表达。 根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。 2.依据重组子结构特征分析的筛选法 2.1重组质粒的快速鉴定 这是重组体的初筛方法，是根据重组质粒和载体DNA之间分子大小的差异来区分重组体的方法。快速提取不同菌落的质粒，进行凝胶电泳检测。插入外源DNA的重组体的在凝胶中迁移的要慢些。 2.2 DNA限制性内切酶图谱分析 目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱（restriction map）发生变化。 例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EcoRI和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3kb，用EcoR I和SalI双酶切后会出现600bp和2.7kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。 2.3 PCR法 PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。 1.λDNA-PstI　　2.阴性产物(未加模板)　　3.以重组质粒为模板的AMBN PCR产物　　4.重组质粒pTZ-AMBN经BamHI和SacI双酶切　　5.载体质粒pTZ　　6.重组质粒pTZ-AMBN　　7.阴性对照　　8.目的产物AMBN　　9.λDNA-PstI 3.核酸杂交法 in situ hybridization 详见第二章。 4. 免疫学方法 直接免疫化学检测同菌落杂交技术在程序上类似。但是它不使用放射性标记的核酸探针，而是使用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要当一个克隆的基因能够在大肠杆菌寄主细胞内实现表达，合成出外源蛋白质，就可以用免疫化学法检测重组体克隆。因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。 抗体可用特定的酶标记，常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处理，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。 免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆。 优点：能够检测不为寄主提供任何可选择的表型特征的克隆基因。 5.DNA-蛋白质筛选法(Southwestern screening) 是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。用于筛选分离表达融合蛋白质的克隆。基本步骤是：用硝酸纤维素滤膜进行“噬菌斑转移”，使其中的蛋白质吸附在滤膜上；再将此滤膜同放射性标记的含有DNA结合蛋白质编码序列的双链DNA寡核苷酸探针杂交；最后根据放射自显影的结果筛选出阳性反应克隆。 由于这项技术是用一种放射性标记的DNA探针