β珠蛋白生成障碍贫血诊断方法.pptVIP

β珠蛋白生成障碍性贫血诊断 分子生物学讨论课 第三部分 |发病机理 β-珠蛋白合成减少，α-珠蛋白合成正常→二者结合后，α-珠蛋白过剩→α-珠蛋白包涵体→粘附于红细胞膜上→红细胞变形性下降→无法通过脾窦壁孔→停留在脾索→α-珠蛋白不稳定→自由基产生增加→氧化红细胞膜蛋白脂质→红细胞膜结构破坏→溶血 第三部分 | β 链 减 少 α 链 过 剩 α 链 聚 集 幼红细胞异常 大多数幼红细胞在骨髓中死亡 少数异常红细胞存活 食物铁 铁吸收增加 铁负荷增加 继发性血色病 低色素性红细胞 含包涵体的红细胞在脾破坏 骨髓膨胀 骨 骼 变 化 溶血 第三部分 |诊断方法 PCR-RFLP PCR-ASO AS-PCR RDB 限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术 等位基因特异性寡核苷酸杂交法 等位基因特异性PCR 反向印记杂交 用PCR扩增目的DNA片段 限制性内切酶酶切割 酶切产物进行电泳 图谱分析 第三部分 | PCR-RFLP 基本原理 第三部分 | PCR-RFLP 突变型基因限制酶切位点消失，限制酶无法对其进行切割，电泳得到片段较大的结果，由此可以与野生型进行区分。 第三部分 | PCR-RFLP 突变情况：β17A→T （CAAG→C↓TAG） 使用酶： MaeⅠ 结果区别： ①正常：产生455bp片段 ②突变： 产生72bp和373bp两个片段 第三部分 | PCR-ASO ASO技术：又称探针斑点杂交技术，是基于核酸杂交的一种基因检测方法。 第三部分 | PCR-ASO PCR-ASO检测结果 第三部分 | PCR-ASO 第三部分 | AS-PCR AS-PCR介绍 设计原理 如果引物的3’端碱基与模板不互补，PCR不能正常进行。 操作过程 设计3’端碱基分别只能与正常模板或突变模板配对的特异PCR引物，并进行PCR，观察是否有产物。 结果分析 如果PCR产物有突变引物特异性扩增带，表明模板DNA有该种突变，反之则表明没有这种突变。 技术特点 无需标记探针即可检出固定点突变。 第三部分 | 反向印迹杂交 反向印迹杂交 一般的斑点杂交 基因样品 基因样品 探针 探针 硝酸纤维素膜或 尼龙膜 第三部分 | 反向印迹杂交 制作ASO探针（正常、突变） 显示正常人RDB结果 父母RDB结果 患儿RDB结果 后代可能突变类型 患者家系RDB结果 谢谢观看