斑马鱼中LMNA基因的克隆Cloning of LMNA gene in zebrafish.pdfVIP

斑马鱼中LMNA 基因的克隆 专业名称：儿科学， 研究生：彭昭虹，导师：何志旭 教授 摘 要 目的：LMNA 基因及其编码蛋白lamin A /C 异常能引起一组人类遗传病,称为核 纤层蛋白病,哺乳动物中 LMNA 基因有 4 个转录本,分别是 laminA、laminC、 laminA laminC 其中 laminA、laminC 是主要的亚型, 目前已证明脊椎动物中该 10, 2, 基因与哺乳动物同源性较高,而在斑马鱼已成功克隆出laminA基因,laminC 基因 尚未克隆出,本实验利用3’RACE 技术克隆斑马鱼laminC 基因，以确定斑马鱼中 LMNA 基因不同的转录本，为进一步研究LMNA 基因转录本的功能，奠定重要的基 础。 方法: 通过收集斑马鱼全时相的胚胎,利用trizol方法提取RNA,后根据3’race 试剂盒所带的逆转录体系将所提取的 total RNA 逆转录成为 cDNA。然后再使用 TaKaRa LA Taq 以反转录的cDNA 为模板，进行套式PCR 反应，套式PCR （巢式 PCR）通过两轮PCR 反应,使用两套引物扩增特异性的DNA 片段,第二套引物功能 特异性扩增位于首轮PCR 产物的一段DNA 片段,从而提高反应的特异性。最后将 PCR 产物直接送测序。 结果：成功运用巢式 PCR 方法克隆基因，得到了 581bp 的片段,并进行了测序, 测序结果与laminA 基因相似度达98%,未克隆到laminC 基因。 结论：通过新实验技术验证了斑马鱼中可能只存在laminA 基因,无laminC 基因, 但因目前 laminA/C 的剪接位点是针对哺乳动物的，斑马鱼是一种较低等的脊椎 动物，所以可能斑马鱼中 laminC 的可变剪接位点不同于哺乳动物，其产生的转 录本有所差异，所以需进一步进行功能试验以验证斑马鱼中有无laminC 基因。 关键词：斑马鱼,核纤层蛋白A,LAMIN 基因,PCR，巢式PCR，3’RACE 本研究受：国家自然科学基金支助项目（基金， 贵州省科技基础条件 平台课题（黔科平台[2009]4005） 主要英文缩略词 缩略词 英文全称 中文全称 LMNA LMNA gene 核纤层蛋白 h hour 小时 RT Room temperature 室温 mRNA messenger ribonucleicacid 信使核糖核酸 PCR polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 hpf hours post fertilized 受精后 3’race rapid-amplification of cDNA ends cDNA 末端快速克隆 min minute 分钟 s second 秒 RNA ribonucleicacid 核糖核酸 rpm Round per minute 每分钟转速 DEPC diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙脂 PBS phosphase buffer saline 磷酸盐缓冲液 cDNA complementary DNA 互补DNA dNTP deoxynucleoside triphospha