RNA提取步骤及注意事项.doc

公开发表或交流时，请注明来源：西南大学 生物技术中心 RNA提取步骤： 65℃，预热15ml（5ml/g）提取缓冲液 ↓ 将2~3g研磨的材料加入，颠倒混匀。65℃水浴，3min （最好准备一个计时器，方便计时） ↓ 氯仿:异戊醇（24:1）抽提，10,000rpm，24℃，5min （用氯仿调平） ↓ 重复上述步骤一次，取上清 ↓ 加入1/4体积的10M/L LiCl，混匀 ↓ 4℃沉淀，过夜（至少6小时），沉淀颗粒状 ↓ 12,000rpm，20min （最好将CTAB与LiCl按4:1配好，用于调平） ↓ 弃上清，500μL SSTE溶解沉淀（或0.5% SDS） ↓ 转到1.5ml离心管中 先加酚，再加等体积的氯仿:异戊醇抽提两次 （酚:氯仿:异戊醇=25:24:1） ↓ 12,000rpm，5min ↓ 取上清，加入2.5倍体积的乙醇，-70℃沉淀至少30min ↓ 12,000rpm，20min，弃上清 ↓ 再用氯仿:异戊醇抽提一次,加乙醇沉淀，离心，弃上清 ↓ 沉淀干燥（真空干燥） ↓ 用已灭菌的DEPC水溶解RNA，-70℃保存 注意： 每次用完RNA都要重新用2.5倍体积的乙醇沉淀，保存在-70℃。（RNA不易降解） RNA沉淀保存在70%乙醇中，可在4℃保存一周；-20℃保存一年 用1%的琼脂糖检测时，RNA量为1μl，加水5μl，再加溴酚蓝指示剂。估计点样量为8μl。 28S(约4. 5 kb) 、18S(约2. 1 kb) 、5. 8 S(5 S)RNA提取缓冲液配方 100ml 200ml 300ml 500ml 备注 CTAB 2g 4g 6g 10g PVP40 2g 4g 6g 10g NaCl 11.7g 23.4g 35.1g 58.5g 1M Tris-HCl＊ 10ml 20ml 30ml 50ml pH 8.0 0.25M EDTA 10ml 20ml 30ml 50ml pH 8.0 1M Spermidine 344μl 688μl 1ml 1.72ml 注意：CTAB、PVP40、NaCl称量好后混匀，再加入EDTA与Spermidine，最后加0.1%的DEPC处理过夜，121℃，15min，在使用前加入2%的巯基乙醇。 ＊： Tris-HCl与DEPC发生反应，应独立配制母液，待其他溶液灭菌后加入Tris-HCl。Tris-HCl所用水为经DEPC处理、高压灭菌后，方可用于配制。 SSTE溶液的配制 100ml 200ml 300ml 备注 NaCl 5.844g 11.688g 17.532g 5% SDS 10ml 20ml 30ml 1M Tris-HCl＊ 1ml 2ml 3ml pH 8.0 0.25M EDTA 400μl 800μl 1.2ml pH 8.0 注意：加0.1%的DEPC处理过夜，121℃，15min。SSTE溶液在较低温度放置时，溶液呈白色混浊状，在使用前，应适当加温。 ＊：Tris-HCl与DEPC发生反应，应独立配制母液，待其他溶液灭菌后加入Tris-HCl。Tris-HCl所用水为经DEPC处理、高压灭菌后，方可用于配制。 所需母液配方 溶质 定容至 需DEPC处理 备注 10M LiCl 42.4g 100ml Y 溶解过程放热，储存于4℃ 0.25M EDTA 9.3g 100ml N pH 8.0 1M Tris-HCl 12.11g 100ml N pH 8.0 5% SDS 5g 100ml N 1M Spernidine 0.5g 3.44ml N 过滤灭菌，储存于-20℃ RNA提取试剂配制方法： 提取缓冲液 2% CTAB 2% PVP（不要用纸称取，PVP具有吸湿性） 100mM/L Tris-HCl（pH8.0） 15min，在用前加2% 巯基乙醇。 注意： Tris-HCl与DEPC发生反应，应独立配制母液（先用HCl调pH，再定容），待其它溶液灭菌后加入Tris-HCl定容到所需体积。Tris-HCl所用水为经DEPC处理、高压灭菌后的，方可用于Tris-HCl的配制。 EDTA与亚精胺都要预先配好母液。 10M／L LiCl 配置过程是放热反应，因浓度要求高，较难溶。 SSTE： 1.0 Mol/L NaCl 0.5% SDS 10 mM/L Tris-HCl（pH8.0） 1 mM/L EDTA SDS需配制母液。 均需要加DEPC处理，之后灭菌。 实验用品的处理及RNA检验： 塑料制品（枪头、管），0.1%DEPC水处理过夜，121℃、15min灭菌。 玻璃（量筒）、金属制品（镊子，用于夹取枪头等），直接180℃、3小时