第四章 细胞工程技术制药.ppt

第一节 动物细胞工程基础 细胞工程：应用细胞生物学、遗传学、发育生物学和分子生物学的原理和方法，按照人们的设计和需要，通过细胞融合、核质移植染色体或基因移植，以及组织、细胞培养等方法，在细胞整体水平或细胞器水平改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品，甚至培养出新物种的一门综合性生物工程技术科学。 细胞工程是在细胞水平进行操作，包括：细胞融合、细胞器移植、染色体工程和组织培养。 研究对象：植物细胞和动物细胞 研究内容：细胞培养、细胞遗传操作、细胞保存和转化细胞生产实践。 遗传操作：细胞融合工程和细胞拆合工程。 一、动物细胞工程发展 1665 英国人罗伯特胡克发现细胞， 1920-1925 使用动物细胞生产多种病毒和细菌疫苗（流感、伤风霍乱疫苗） 1951 Earle 研究的体外动物细胞培养液标志着近代动物细胞培养开端，大量动物细胞培养生物制品出现。 1967 Van Wezel 研制出细胞贴壁培养的微载体，促进了细胞在反应器培养，提高了生产率。 1975 免疫学家Kohler 等利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合选择出能分泌单一抗体的杂种细胞，建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。 20世纪70年代 基因重组合杂交瘤技术促进了动物细胞技术的进步。 1997 克隆羊多莉诞生，促进了转基因和克隆生命科学的进步。目前，60%的重组蛋白类生物制品均是中国仓鼠卵细胞系中表达。 二、动物细胞形态、结构和生理特点 1、形态 真核生物细胞结构复杂、分化精确，不同细胞具有不同功能。细胞体积较小，肉眼看不见，需要借助显微镜才能观察到，测量单位为微米、纳米和埃。细胞直径在10-100微米，细胞形态千姿百态，一般为球形或近球形，也有扁圆形和梭形。 2、细胞结构 3、细胞生理特点 细胞分裂期长:12-48h 生长需要贴附于基质,并有接触抑制现象； 正常2倍体细胞寿命有限： 对周围环境敏感： 对培养基要求高： 细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同： 依据动物细胞生理特点，作为宿主细胞生产药物的缺点是培养条件高、成本高、产量低，但多数蛋白可以分泌到细胞外，提纯方便，蛋白质经过糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床使用。 各类细胞周期时间表 在玻璃、塑料等基质上生长，与电荷、钙美离子、贴附因子有关。 在无血清培养基上：少 血清、塑料瓶/玻璃瓶，生长密度80%左右为佳。及时传代！ 离体培养开始时间为原代培养，经过若干代后细胞趋于死亡，大约50代。加入表皮生长因子可以150代。转化为异常体后成为无限细胞系，成为永生化细胞。 细胞膜对理化因素（渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素），一切导致脂质和蛋白质变性的因素都影响动物细胞的存活。 原核细胞：碳氮源和无机盐就可以， 动物细胞：12种氨基酸、8种维生素、多种无机盐、微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子、血清。 蛋白质合成途径有差异 动物细胞蛋白质在游离核糖体和粗面内质网都可以合成，且内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，而且需要糖基化。 原核细胞则没有糖基化过程。 蛋白质糖基化与细胞功能有关，因此，有些生物药品不能用原核细胞表达，动物细胞来源的生物药物比重越来越大。 三、细胞培养特点 污染概率大 培养环境无菌是细胞生长的必要条件 营养需求高 除了氨基酸还要一些维生素、生长因子等 环境适应性差 细胞适应环境能力差，需要长时间驯化 培养条件严 培养环境要严格控制 代谢废物毒性大 细胞离体培养时失去对外界的防御能力，要及时清除代谢物 检测控制指标多 培养过程要对细胞不同指标加以检测 载体生长依赖强 培养过程要有载体以便细胞附着生长 四、生产细胞系及冷冻保存 （一）动物细胞系 1、原代细胞 直接取自组织、器官经过粉碎后获得的细胞，生产中需要量大，常用有鸡胚细胞、原代兔肾细胞等。 2、二倍体细胞 经过原代细胞处理后的，具有某种特征的细胞株，还具有正常细胞特点，（2n核型、贴壁依附和接触抑制、有限增殖、无致瘤性）常见有WI-38、MRC-5、2BS，一般用于制备疫苗。 3、连续细胞系 分化不成熟、获得无限增殖能力的一种细胞株，无正常细胞特点。常见有CHO-K1构建工程菌、BHK-21也可以生产疫苗、Namalwa制备疫苗。 4、基因工程细胞系 根据实际需要，在分子水平上进行设计、改造、重组而获得的细胞。 （二）冷冻保存 1、冷冻保存与复苏 低于-70°下，细胞将减慢反应速度甚至停止，因此，利用冷冻保护剂一一定的冷冻速率将温度将至一定温度加以保存细胞。最好方法是利用液氮保存，可达10年。在冷冻时，要考虑速率、冷冻剂、冷冻温度和复苏时的复温速率。 2、冷冻保护剂 可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。常配制成一定浓度溶液，除了