WB检测蛋白实验报告范本 - 上海秉新生物科技有限公司.doc

实验报告书 项目名称：Western blotting检测组织中蛋白表达 客户姓名： 合同号： 项目负责人 实验仪器与试剂 表格一：实验仪器 仪器 厂家 型号 小型垂直电泳槽 Biorad 164-8001 转印槽 Biorad Trans-Blot 脱色摇床 常州澳华 TY-80B 电泳仪 上海天能 EPS-200 低温高速离心机 64R BECKMAN 酶标仪 Thermo Scientific Multiskan Spectrum 表格二：试剂 试剂 厂家 RIPA裂解液 碧云天 PMSF Amresco BCA蛋白定量试剂盒 Thermo Tris Amresco 甘氨酸 Amresco 盐酸 国药集团 甲醇 国药集团 Tween 20 国药集团 SDS 国药集团 TEMED Sigma BSA Sigma PVDF膜 Millipore HRP标记的羊抗小鼠二抗 联科生物 化学发光检测试剂 Thermo GAPDH鼠单克隆抗体 联科生物 预染蛋白marker 碧云天 X光胶片 柯达 实验步骤 组织中蛋白上清液的制备和浓度测定 (1) 把组织剪切成细小的碎片； (2) 加入200μL裂解液，在匀浆机中研磨，直至裂解液中组织消失； (3) 充分裂解后，12000rpm离心5min，取上清。 (4) 取部分上清蛋白用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按如下步骤： ①按试剂盒说明书将A液和B液以50：1的比例配制成工作液； ②取2000μg/mL的BSA标准品，用PBS(pH 7.4)稀释成2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL共9个浓度梯度； ③取上清液10μL，用PBS稀释20倍； ④每管中加20μL蛋白标准品或稀释后的上清液，再加上述工作液0.2mL，37℃孵育30min，562nm处测吸光度，记录OD值； ⑤根据蛋白标准品的浓度及相应OD值绘制标准曲线： 根据标准方程计算样品总蛋白浓度（mg/mL） 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 OD值 0.817611 0.438412 0.657716 0.675617 0.362568 0.817774 0.688089 0.477546 0.627511 0.991314 0.517018 0.814846 0.748083 0.460470 0.622999 0.574448 0.404516 0.700393 均值 0.904462 0.477715 0.736281 0.711850 0.411519 0.720386 0.631268 0.441031 0.663952 浓度 mg/mL 21.46 9.27 16.66 15.96 7.38 16.21 13.66 8.22 14.59 2、Western-Blot检测总蛋白中目的蛋白表达。 (1) 灌胶 ①蒸馏水清洗灌胶玻璃板，竖直晾干。 ②配制13％10mL，加TEMED10μL、10％100μL，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘2～3mm45min待胶完全聚合。 ③待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。 ④配制4％ 5 mL，加TEMED 5 μL、10％APS 50 μLTeflon齿梳，室温静置 20 min待胶聚合。 ⑤待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。 (2) 电泳 ①取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度为6μg/μL，和等体积2×上样缓冲液混合，即为上样液。 ②将上样液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/min离心1min。 ③每孔加上样液15μL，留一孔加10μL预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用80v恒压电泳，约20min，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用110v恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源，取出胶板。 (3) 转印蛋白及免疫检测 ①在电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH2O漂洗2min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。 ②在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。 ③按黑面（负极）→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→红面（正极）的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。 ④接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。 ⑤将电转仪置于冰水中，100V恒压转膜1h。 ⑥转膜结束后，快速取出PVD