基因工程菌生产rhGCSF发酵培养基的研究.docx

中国生物工程杂志第23卷第11期CHINA BIoTECHNOLOGY 2003年11月基因工程菌生产rhG．CSF发酵培养基的研究+王海波1“ 欧俊杰z耿信笃zTQl2fl中国人民解放军第四军医太学化学教研室西安710032)2西北大学现代分离科学研究所陕西省重点实验室西安710069)摘要在摇瓶中对工程茵DH5alpOV220生产rhG．CSF的发酵培养基进行了研究。从几种常用的 细菌培养基中筛选适合工程茵表达rhG-CSF的M9培养基。利用正交试验优化出生产重组人 rhG—CSF的优化培养基配方，其中优化碳源含量为2％的葡萄糖，氮源为2．5％的酵母粉、3％的蛋 白胨和0．1％的(NIL)：SO。以夏少量的无机盐。使用优化培养基可使rhG．CSF的表达量达到33．8％，比优化前提高了48．9％。关键词 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG．CSF) 重组大肠杆菌发酵培养基G．CSF具有促进粒系造血干细胞增殖分化及 简写为Amp，50r喘／r,a)，30C，220r／rain培养至混浊， 增强成熟细胞功能的作用，对于骨髓移植时促进中 接种于装有实验培养基的锥形瓶中培养至所需浓 性自细胞增加、癌症化疗时引起的严重的中性粒细 度，42℃诱导表达4h。 胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞 1．4结果分析 缺乏症均有明显的疗效，但其天然产物来源非常有 1．4．1菌体浓度 比色法测定，以OD。值表示。 限，而基因工程的重组G．CSF的生物学活性与天然1．4．2测定rhG．CSF的表达量发酵液菌体做 的相似，且可大规模生产 。 SDS．PAGE，用Cs．930双波长扫描仪(Shimadzu)扫培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖、代 描测定rhG．CSF的表达量。谢和合成人们所需产物的营养物质，同时，也为微1．4．3pH pHS一25型pH计测定。 生物等提供除营养物质以外的其他生长所必需的1．5试剂 环境条件。培养基的组成和配比是否恰当，对微生酵母粉(yeast e】【tmct，OXOID)、蛋白胨(trpytone 物的生长、产物的形成、工艺的选择、产品的质量和 ，OXOID)、酸水解酪蛋白(casein enzymatic 产量等都有很大的影响。本文对工程菌DH5a／hydrolysate，SIGMA)、葡萄糖、甘油、蔗糖、磷酸二氢 加化20发酵培养基进行了研究和改进，确定出适钾、磷酸氢二钠、NaCI、NaOH、硫酸铵(以上试剂均 合工程菌生长和rhG．CSF表达的优化培养基配方。为分析纯，天津石英钟厂霸州市化工分厂)1材料与方法2结果与讨论1．1菌种2．1不同培养基种类对工程菌生长和衰达的影响 基因工程菌由本所分子生物学实验室构建对五种常用的工程菌发酵培养基LB、M9、1．2培养基”1 MBL、2×YT、LBG进行了筛选，结果如表l所示。M9，LB。2XYT，LBG，MBL由表1看出，在M9培养基中，rhG．CSF的表达量明1．3摇瓶发酵法01显高于其它4种培养基，可达23．9％。这与M9培—70℃甘油管冻存之工程菌接种子装有所需 养基中碳源、氮源和无机盐等的存在，从而使营养 培养基的小试管中(所有培养基均含氨苄青霉素，物质较为平衡有关。与M9相比，2 x YT、MBL、LB、LBG培养基中营养物质比较单一，不利于工程菌的收稿日期：2003-07．08惨回日期：2003—09-15*国家自然科学基金资助项目 生长，使rhG．CSF的表达量较低，而M9培养基中含**电子信箱：whb769l@163 corn 有丰富的碳源、氨源、无机盐等成分，因此，实验中 万方数据第ll期 王海波等：基因工程菌生产rhC,-CSF发酵培养基的研究 69选用M9培养基作为研究的基本培养基，并对其中求最佳水平．故进行方差分析，分析结果见表4。 的碳源和氮源含量配比进行进一步的优选。衰3优化培养基配方正交试验的测定结果裹1培养基种类对rhG．CSF裹达■的影响培养基种类MBL LBG 2 xYT LBM9rhG-CSF表达量％19 320I 20 422 323 92．2 M9培养基的优化2．2．1培养基中碳源和氮源配比的优化 常用的 碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。葡萄糖是碳 源中最易利用的糖，所以葡萄糖常作为培养基的一 种主要成份，并且作为加速微生物生长的一种有效 的糖。重组大肠杆菌中的葡萄糖代谢已被深A研 究““。。常用的氮源可分为有机氮源和无机氮源 两大类。有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游 离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机 盐、维生素及某些生长因子。因而微生物在含有有 机氮源的培养基中常表现出生长旺盛，菌体浓度增 长迅速的特点。微生物对无机氮源的吸收利用一 般比有机氮源快，所以也称之为迅速