多肽的化学合成 - 山东大学课程中心0.ppt

多肽的化学合成 与氨基保护基比较，羧基保护基种类较少； 一般以盐或酯的形式加以保护； 常用的有钾盐、钠盐、三乙胺盐等； 常用的酯类有：甲酯和乙酯、苄酯 、叔丁酯； 叔丁酯是近年来最常用的羧基保护基。 羧基的羟基不是一个好离去的基团； 羧基本身不是一个最好的酰基化剂； 羧基的活化是将羧基转变成一个活泼的羧基衍生物，提高羧基的酰化能力。 叠氮法、混合酸酐法和活化脂法均是温和的方法，已经被广泛应用于肽的合成 最早使用的方法； 氨基酸的酰氯容易与氨基作用形成肽键； 由于反应过程中容易引起氨基酸消旋化，实际应用价值小。 氨基酸的羧基可以转化成酸酐； 酸酐有两个亲电中心，在形成肽键时能够产生几乎等量的副产物，应用不对称酸酐可以克服此缺点； 氨基被保护的氨基酸在低温且有叔胺的存在下与氯甲酸乙酯生产成混合酸酐能与另一个氨基酸脂缩合成肽 在无水溶剂中可以减小消旋，保持很低的水平。 普通的氨基酸烷基酯就可以酰化另一氨基酸的氨基； 氨基被保护的氨基酸对硝基苯脂能与另一氨基酸的氨基缩合成肽，此法作用温和、产率较高； 但如不够活泼时，可以在酯基内加入强吸电子基因，以增加羧基的亲电能力，使更容易形成酰胺键。 2、偶联剂缩合法 偶联剂本身是一种脱水剂，能够促进羧基和氨基之间的缩合反应 缩合剂可以直接与一个羧基被保护的氨基酸和一个氨基被保护的氨基酸一起反应； （三）多肽的固相合成 液相合成法 固相合成法 液相合成法 可以分为逐步延长法（stepwise elongation)和片段缩合法(fragment condensation)。 前者常用于合成小肽，后者用于合成比较长的肽链。其中的片段缩合法可以分为大片段缩合法、较大片段缩合法和较小片段缩合法三种。 液相合成法最经典的例子是牛胰RNaseA的合成。 固相合成法的基本原理 先将所要合成目标肽链的C-末端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连； 然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与；另一分子氨基酸的羧基作用（用DCC做偶联剂）形成肽键； 重复（缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得到目标的多肽。 树脂的选择 将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求： 必须包含反应位点（或反应基团）； 必须对合成过程中的物理和化学条件稳定； 允许在不断增长的肽链和试剂之间快速、不受阻碍的接触； 提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。 固相合成法的类型 在固相合成绝大多数常用二氯甲烷为溶剂； a-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法， a-氨基用Fmoc（芴甲氧羰基）保护的称为Fmoc固相合成法。 丁氧羰基（Boc）固相合成法 侧链保护基采用苄醇类； 常用树脂为氯甲基化聚苯乙烯树脂或羟甲基化聚苯乙烯树脂或对乙酰基苄脂树脂； Boc保护α-氨基的氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端 再偶联下一个氨基酸，……。 缺点：反复用酸脱除保护基，然后用氟化氢把肽段从树脂上裂解下来，不可避免地会引起或多或少的副反应；某些侧链保护基的不稳定，已经延长的肽链从固相支持物上的逐步损失，还有天冬氨酸、谷氨酸残基的侧链变化…… 丁氧羰基（Boc）固相合成法 Fmoc固相合成法 C末端氨基酸与树脂结合 Na-Fmoc的脱除、洗涤 偶联、洗涤 重复(2)～(3)步 脱保护基 固相合成法对于肽合成的显著的优点 简化并加速了多步骤的合成； 因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失； 固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间产物的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失； 固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。 固相合成存在的主要问题 固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物; 必需通过可靠的分离手段纯化。 可溶性的问题 许多合成的肽粗品，尤其是那些经过几次沉淀和干燥的，在标准的HPLC溶剂中十分难溶，原因为：? 含有大量的疏水性残基，它们会象油一样紧密的拥成一簇，以减少与水的接触并增大? 分子之间的疏水性作用。? 非特异性的聚集。 含有Cys的肽中形成二硫键。? 二级结构的形成，特别是较长的分子。 活性侧链（包括各种类型的氢键、盐桥等）之间的特异性相互作用 肽的溶解 对于含有芳香或者烃侧链的氨基酸（Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Ala），加