微生物学综合实验报告.doc

综合实验报告书 （2011 ~2012学年） 实 验 题 目 大肠杆菌抗药性突变株的分离 学院名称 生物与食品工程学院 专 业 （班 级） 生物技术09-1班 姓 名 （学 号） 李顺起 讫 日 期 2011.11.26-2011.11.31 指 导 教 师 李军红 2011年 月 日 , 采用梯度平板法, 利用链霉素, 尝试了对经紫外线诱变的菌株进行耐药性菌株的分离及抗性水平的确定。诱变前的大肠杆菌对链霉素有一定的抗性，。经过紫外诱变后,大肠杆菌对链霉素的抗药性增强，实验未能分离出纯种的抗性菌株。 关键词：大肠杆菌 分离 抗药性 梯度平板法 Abstrack : By the laboratory e. coli strains for starting, gradient plate method, using streptomycin, try to the strains of ultraviolet mutagenesis resistance strains on the separation and determination of the resistance level. Mutation of e. coli before to streptomycin have certain resistance,. After uv mutagenesis, escherichia coli to streptomycin resistance to strengthen, the experiment failed to separate out of the pedigree of the resistant strains. Key words : escherichia coli isolation drug- resistance Gradient plate method 前言：本实验学习用梯度平板法分离抗药性突变株。实验基本原理是基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。微生物的抗药性突变是DNA的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为诱发突变的诱导物。因而在含有一定浓度抑制物药物的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上长成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性实验，就可以得到所需要的抗药性菌株。抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是十分必要的。为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验拟采用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板的方法是：先倒入不含药物的底层培养基，把培养平板斜放，凝固后将平板平放，再倒入含有链霉素的上层培养基，这样便可得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板。在此平板上涂布大量敏感菌，经过培养后，在链霉素浓度比较高的部位长出的菌落中可分离到抗链霉素突变株。 材料和方法 1.1 材料 菌种 大肠杆菌，由微生物综合实验室提供。 培养基和试剂 LB培养基，生理盐水，无菌水，链霉素。 方法 菌体培养：接种大肠杆菌于盛有LB培养基的试管斜面上，37℃培养24h。 菌悬液的制备：将上述试管斜面中加入适量的无菌生理盐水，用接种环刮去斜面上菌体，震荡摇匀制成菌悬液。 梯度平皿的制备：在热水浴中溶化LB琼脂培养基。倒10ml已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固。在已凝固的平板底部高琼脂这一边标上“低”，并放回水平位置，然后在底层培养基上加入每毫升含有100μg/ ml的梯度平板（如图）。 紫外线诱变：①将紫外灯（15W）打开预热20min②取直径6cm无菌平皿3套，分别加入上述3个稀释度的菌液3mL。③将上述3套平皿置于紫外灯下，打开皿盖，在垂直距离为30cm处照射2min,3min,4min,5min。盖上皿盖，关闭紫外灯 诱变后抗药性及分离抗性突变株①制备不含药物的LB培养基.②制备每毫升含有100μg链霉素的LB培养基. ③在上述诱变过程中，同样地每照射一次后从每套平皿的菌液中，取0.1mL，涂布于梯度平板上，把平板倒置在37℃下避光培养24h，记录菌落生长状况,分离出生长较好的菌株.培养24h 诱变菌株扩大培养：将上述诱变后的菌体接种到含LB培养基的试管斜面上，37℃培养24h。 诱变菌株菌悬液的制备：将上述诱变后的菌体试管中加入适量的无