γ-球蛋白沉淀.PPT

实验六血清γ－球蛋白的分离、纯化 一、实验目的 1. 了解盐析法分离、纯化蛋白质的原理。 2. 熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。 二、实验原理 （一）蛋白质盐析 蛋白质溶液属于胶体系统，蛋白质分子表面的亲水基团，如-NH2、-COOH、-OH以及-CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化膜，另一方面，蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。因此蛋白质在水溶液中比较稳定而不易沉淀。 较高浓度的中性盐与水有亲和性，与蛋白质争夺水分，因而破环蛋白质颗粒表面的水化膜。同时，由于这些盐是强电解质，离子浓度相对较高，可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷，破坏蛋白质的双电层。这样，使蛋白质成了既不含水化膜又不带电荷的不稳定颗粒，从而容易沉淀。 血清中蛋白质一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白 。 血清中各种蛋白质所带电荷多少、颗粒大小及亲水程度都不一样，因此盐析时，所需要的盐浓度也各不相同。例如50%饱和度的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。 （二）浓缩 采用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于烧杯中，并在透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000) 或聚乙烯吡咯酮，蔗糖等，它们均具有很强的吸水能力，可将透析袋内的水分迅速吸出，达到浓缩的目的。 三、实验器材 1.离心机 1台 2.透析袋 1个 3.烧杯100ml 1个 4.移液管 5.胶头滴管 四、实验试剂 1. 小牛血清 2. PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.2） 3. 饱和硫酸胺溶液（pH7.2 ） 五、操作步骤 1. 盐析 2. 浓缩 六、注意事项 1.所用血清应新鲜，无沉淀及细菌滋生。 2.盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入速度不能过快，一定要边滴加边搅拌，以减少局部高浓度硫酸铵所引起的共沉现象，搅拌速度不宜过快，以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。 3.所添加的硫酸铵应为化学纯或更高纯度，否则夹带的杂质会使硫酸铵的浓度不准确，甚至引起蛋白质和酶的变性。添加硫酸铵后，要使其充分溶解，至少放置30min以上，待蛋白质沉淀完全，然后将沉淀分离。 七、思考题 1.为何硫酸胺能沉淀蛋白质? 2.第一次盐析时硫酸胺的饱和度是多少? 3.第一次盐析时沉淀的是何种蛋白质，使沉淀溶解再次盐析的目的是什么? * * How to use? 离心管：2ml血清+ 2mlPBS 缓慢加入：4ml 饱和硫酸胺溶液（边加边摇） 摇匀 静置15min；离心10min(3000转/分钟) 倾弃上清液 How 沉淀+1ml PBS + 0.5ml 饱和硫酸胺（缓慢滴加） 静置10min；离心10min(3000转/分钟) 倾弃上清液 沉淀，即为γ－球蛋白 摇匀 摇匀 饱和度？ 饱和度？ 蛋白质沉淀+ 1mlPBS 沉淀完全溶解后 倒入透析袋，用绳子扎紧，置于加有蒸馏水的100ml烧杯中 2h后，收集透析袋内液体 将液体放在试管中 ，置冰箱中保存待用