利用细胞吸附态和内态Cu分离技术探究三角褐指藻吸收利用Cu机制.doc

利用细胞吸附态和内态Cu分离技术探究三角褐指藻吸收利用Cu机制 　　【摘 要】溶解态铜（Cu）在水体中以络合态与游离态的形式存在，通过吸附以及吸收等方式进入藻细胞，从而影响其生长和生理代谢。然而，受研究方法限制，我们对藻类吸收利用Cu机制仍不十分清楚。本文在添加了系列浓度Cu的培养基中培养三角褐指藻，采用了一种草酸清洗以分离细胞壁上吸附态与内态Cu的方法，来研究不同铜浓度的条件下，藻类吸收利用Cu的过程。结果表明：由于EDTA的存在，培养基中的Cu大部分以络合态形式存在，游离态Cu2+浓度很低，但是，微量的Cu2+对藻的生长代谢也有一定影响；随着培养基中Cu2+的增加，细胞吸附态Cu显著增加，而内态Cu有少量增加，反映了生物的自我保护机制。通过模拟，藻细胞吸附与吸收Cu的方程为： y吸附=exp（0.58*ln（x） - 0.22），R2=0.97，y吸收=exp（0.57*ln（x） - 1.68），R2=0.94。 【关键词】铜；吸附吸收机制；草酸洗液；三角褐指藻 1.前言 近年来，含Cu等重金属的工农业废水、城市生活污水以及采矿废水等向水体大量排放，使水体环境中Cu含量显著增加[1，2]。Cu对生物体扮演双重角色，低浓度时参与新陈代谢反应[2]，但超过一定的阈值则对生物体有毒性作用[3]。除了用总溶解态Cu来指示其对生物的影响外，Cu在水体中的存在形态也是很重要的指标：溶解态Cu大部分以络合态的形式存在，游离态Cu2+在水体中含量很少，当被吸收至细胞内时，会影响生物的生长生理代谢[4]。先前有很多针对水体中高浓度Cu与藻相互作用的报导[5，6]，但对于微量Cu2+的存在条件下，藻细胞如何吸收Cu的研究较少。目前用于研究生物吸收吸附金属的方法尚有不足，因此需要建立一种新的方法来做更深入的探索。 三角褐指藻（Phaeodactylum triconutum）属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻属。近岸水体发生藻华时，硅藻常常是优势种，而三角褐指藻的分布范围较广且易于在实验室内进行培养，因此常被用来作为海洋浮游生物毒性测试的实验材料。本文用添加了不同浓度Cu的培养基对三角褐指藻进行培养，利用草酸洗液清洗的技术高效分离出细胞内态的Cu和细胞壁上吸附的Cu，对藻细胞吸附吸收Cu的机制进行探讨。 2. 材料与方法 2.1 实验材料 三角褐指藻 （Phaeodactylum triconutum Bohlin），strain CCMA 106，于2004年在南海中分离，由厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室的海洋微型生物保种中心获取。培养基由过滤后的南海表层海水（Seats站：116°E， 18°N）添加Aquil溶液[7]制得。藻在正式应用于实验之前，培养20个世代，温度维持于20 ± 0.5 ℃，用冷白色荧光灯管照明，光强为140 ?mol photons.m-2.s-1，光暗周期比是12∶12 h。添加生长良好的指数生长期的藻液于培养基内进行培养。 2.2 实验方法 2.2.1 培养 实验所用培养液与器皿均经高温灭菌消毒。实验采用Nalgene 4L圆柱形瓶，在GXZ智能型光照培养箱（宁波江南制造厂，中国）内20℃恒温培养，光照强度为140 μmol?m-2?s-1，光暗周期比为12∶12 h。培养基中加入CuSO4的浓度依次为：0 μmol?L-1， 0.25 μmol?L-1， 0.5 μmol?L-1， 1.0 μmol?L-1， 2.0 μmol?L-1， 4.0 μmol?L-1， 8.0 μmol?L-1， 16.0 μmol?L-1，每个浓度设3个平行样。在上述的浓度下，三角褐指藻的初始接种密度为85000 cells?mL-1，经过72h的培养后取样处理测定。 2.2.2 细胞内金属以及细胞吸附态金属的区分和测定 实验采用Tovar-Sanchez等在2003年报导的使用草酸洗液清洗藻细胞的方法来区分细胞壁上吸附的以及细胞内的Cu[8]。该方法的原理为：细胞壁上吸附有铁氧化物，Cu等金属会吸附在这些铁氧化物上，当添加草酸洗液时，其主要成分草酸溶液会和细胞壁上的铁氧化物发生氧化还原反应，进而洗去吸附在细胞壁上的金属。同时草酸洗液中也添加了EDTA以及柠檬酸盐等具有螯合性的试剂，提高了去除吸附态金属的效率。该方法可以去除97%的吸附态金属，且不会导致细胞裂解。草酸洗液还具有稳定性强，便于在实验室中操作的特点，因此可以用来高效的区分细胞内部以及细胞壁上吸附的金属。 培养72 h后，将样品拿至100级的洁净室内，用量筒取100 mL藻液，经过0.45 μm聚丙烯膜过滤。将滤膜放置于消解罐中，加入1.5 mL 浓HCl和0.5 mL浓HNO3