第二十一章分子生物学常用技术与人类基因组计划教材精要与重点.DOC

第二十一章 分子生物学常用技术 与人类基因组计划 [教材精要与重点提示] 一、分子杂交与印渍技术 1．分子杂交 在DNA复性时，如把不同DNA分子或DNA与RNA分子放在同一溶液中，只要这些核酸单链分子之间存在一定程度的碱基配对关系，就可在不同分子间形成杂化双链，这种现象称核酸分子杂交。 2．印渍技术 是将存在于凝胶中的生物大分子转移于固定化介质上并加以检测分析的技术。 3．Southern blotting 将限制性内切酶酶切电泳后的DNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。 4．Northern blotting 将电泳后的RNA转移至NC膜上,再与核酸探针杂交的技术。 5．Western blotting 将聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白质转移至NC膜上，再与另一标记蛋白质分子(如抗体)杂交的技术。 6.Oot blotting 不经电泳分离直接将样品点在NC膜上用于杂交的技术。 7．In situ hybridization 在组织切片或细胞涂片上直接与探针杂交的技术。 8．DNA芯片技术 指采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断。由于常用硅芯片作为支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，故称基因芯片技术。 二、PCR(聚合酶链反应)技术 1．概念 是一种快速简便的体外DNA扩增技术，能在很短时间内，将几个拷贝的DNA放大上百万倍。 2．工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，使目的DNA片段得到大量扩增。其反应体系包括：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+的缓冲液。 3．反应步骤 (1)变性 95℃ 15s (2)退火 Tm-5℃ 一般为55℃ (3)延伸 72℃ 1.5min 此三步为一个循环，一般进行25—30次循环。 4.用途 目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA微量分析等。 三、核酸序列分析 1.化学裂解法(Maxam—Gilbert法) 2.双脱氧末端终止法(Sanger法) 大体有四步 (1)模板—引物杂交 (2)引物延长与合成阻断 (3)电泳 高压超薄聚丙烯酰胺凝胶电泳 (4)放射自显影直读图 本法用的酶是DNA聚合酶I的K1enow大片段,实验的关键是ddNTP：dNTP的 比例要适当。 四、人类基因组计划(HGP)与后基因组研究 1．HGP主要研究内容是完成 遗传图，物理图，转录图，序列图，然后对资料进行储存和利用。 2．后基因组主要研究内容 (1)功能基因组学 (2)蛋白质组学 ． 五、疾病相关基因的克隆与鉴定 1．功能性克隆策略 指从对一种致病基因的功能的了解出发克隆该致病基因的策略。血友病的第Ⅷ因子基因是以此策略克隆成功的。 2．定位克隆策略 指从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围。最后克隆该基因的策略。 DMD致病基因是以此策略克隆成功的。 3．候选基因克隆策略 是利用HGP的成果和基因网站提供的基因序列数据克隆致病基因的策略。包括非定位候选基因克隆策略和定位候选基因克隆策略。 六、转基因、核转移与基因剔除技术 1．转基因技术 指将目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使发育成个体。该个体能把目的基因继续传给子代，该技术称转基因技术。目的基因的受体动物就是转基因动物。 2．核转移技术 ， 即动物整体克隆技术。是将动物体细胞胞核全部导入另一个体的去除了胞核的受精卵内，使之发育成个体的技术。 3．基因剔除技术 指有目的的去除动物体内某种基因的技术，也叫基因靶向灭活。 (测试题) 一、名词解释 1．blotting(印渍技术) 2．Southern blotting 3．Northern blotting 4．Western blotting 5．dOt blotting 6．DNA芯片技术 7．PCR 8．功能基因组学 9．蛋白质组学 10．功能性克隆 11．定位克隆 12．转基因技术 13．核转移技术 14．基因剔除 15．分子杂交 二、填空题 16、Southern blotting、Northern blotting和Western blottin