pHCN4-DsRed Express2慢病毒载体的构建和鉴定.pdfVIP

中国心血管病研究2010年 8月第 8卷第 8期 Chine5eJournalofCardiovascularResearch，August2010，。z ，Ⅳ0～ ．593． pHCN4一DsRedExpress2慢病毒载体的 构建和鉴定 ConstructionandidentificationofpHCN4-DsRedExpress2lentiviralvector 李颖 高飞 蔡军 秦选光 作者单位：100020 北京市，首都医科大学附属北京朝阳医院儿科 通讯作者：秦选光，E—mail：cvek2008@sina．c0 【摘要】 目的 构建超极化激活环核苷酸 门控阳离子通道基 因亚型4启动子(HCN4)重组慢病毒载 体并进行鉴定 。方法 采用 Gateway克隆技术 ，通过attBxattP反应 ，构建穿梭质粒 pUp—HCN4，而后将 pLV／ Des2一Puro、pUP—HCN4、pDown—DsRedExpress2三个质粒通过 attLxattR反应 ，构建成 pLV／EXPN2一Puro— HCN4一DsRedExpress2质粒 ，再转染感受态细胞 stbl3，孵育扩增 ，离心纯化 。采用 PCR方法对重组慢病毒载 体进行鉴定。结果 基于位点特异性重组原理 ，应用Gateway克隆技术构建了多基因共表达的pHCN4一 DsRedExpress2慢病毒载体 ，通过提取 DNA测序 ，证 明该序列与理论值一致 。结论 应用 Gateway克隆技术 成功构建了pHCN4一DsRedExpress2慢病毒载体。 【关键词】 HCN4；慢病毒载体 ；Gateway克隆技术 doi：10．3969／j．issn．1672-5301．2010．08．012 中图分类号 Q782；Q785 文献标识码 A 文章编号 1672—5301(2010)08—0593—04 ConstructionandidentificationofpHCN4一DsRedExpress2lentiviralvector LIYing，GAOFei，CAIJun，eta1．DepartmentofPediatrics，BeijingChaoyangHospital，Beijing100020，China Correspondingauthor：QINXuan-guang，E-mail：cyek2008@sina．com [Abstract] Objective Toconstructand identificationofpHCN4一DsRedExpress2 Lentiviral vector． M ethods TheGatewayCloneTechnologywasused in ourexperiment．First，theentry clonespUp-HCN4 were constructedbyBPrecombinationreaction．Secondly，performedanLR recombinationreactionamong pUP-HCN4， pDOWN—DsRedEepress2andpLV／Des2-Purotogenerateexpressionclones．Finally，plasmidswereidentifiedby sequenceanalysis．Results Thesequenceanalysisconfimr ed thattheHCN4promoterWaSsuccessfullyinserted in—— tothelentiviralvector．Conclusion Therecomb inantlentiviralcontainingHCN4promoterissuccessfullycon—- struetedbythemethodoftheGatewayTechnoloyg ． [Keywords] HCN4；Lentivirus；Gatewayclonetechnoloyg 正常心脏的节律有赖于窦房结发放冲动及完 基因是心脏起搏细胞特异性的基因。因此，本研究 善的传导系统。心肌组织的再生能力非常有限，大 利用较为先进的Gateway克隆技术，以慢病毒载体 面积不可逆性损伤可导致永久性心功能损害。缺