试验一植物dna的提取与纯化.docVIP

实验一 植物DNA的提取与纯化 一、实验目的： 掌握植物DNA的提取与纯化的原理和一般步骤。 二、实验原理： 植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求；2. DNA必须完整；3. DNA应当有足够的量。 一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。 提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。本实验采用SDS法提取DNA。SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 三、实验材料和试剂： 1.实验材料：新鲜植物组织（小麦嫩叶）。 2.器材：研钵和研棒、水浴锅、离心机、移液器及枪头、离心管。 3.药品试剂：提取液、无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液、氯仿:戊醇（24:1）。 四、实验步骤： 1.取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中； 2.在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite， 充分混匀； 3.在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀； 4.冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右； 5.室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，-20 ℃放置1h； 6.挑出DNA置于新的管中。加入适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次； 7.吹干DNA，加入适量TE在65℃溶解，4℃或-20℃贮存。 五、实验结果： 如下图所示，所提DNA的琼脂糖凝胶电泳结果如示： 其中第八泳道（从右至左，箭头所指）为我们所提DNA的电泳结果。可以看出有两条比较亮的带，其中靠近点样孔的条带为DNA带，远离点样孔的条带为RNA带。由于此次实验没有对RNA消化，所以泳道有RNA条带。 六、注意事项： 1. 尽量取材幼嫩组织，最好在早晨取材，可以避免过多的糖分污染； 2.提取液不能加入过多，否则影响后续反应的进行； 3.加入提取液后应多次颠倒混匀，以确保反应充分进行，颠倒不能过于剧烈，剧烈颠倒会导致DNA分子的断裂； 4.加入氯仿:戊醇后要剧烈摇晃，确保杂质去除彻底； 5. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中。 实验二 PCR和分子标记技术及其应用 一、实验目的： 掌握PCR的基本操作及分子标记技术的应用。 实验原理： PCR原理：类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。分子标记具有数量丰富、信息量大、与生长发育无关，取材不受限制；较多共显性，信息量完整在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约。可以用于种质资源研究、品质纯度鉴定、构建遗传连锁图、基因定位（QTL）、标记辅助选择、比较基因组研究、基因克隆（图位克隆）、生物起源进化的研究。 （1）RFLP 物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。优点：共显性，非常稳定。缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱； 用作探针的DNA克隆制备、保存不方便。 （2）RAPD 只需一个长度9-10个核苷酸的随机引物，退火温度低。优点：实验步骤少，省工、省力、进度快; 不需先知道基因组