肝癌抗原肽(EPVTKAEML)和人HSP70融合基因构建和原核表达.docVIP

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)和人HSP70融合基因构建和原核表达 　　摘要：目的： 构建及原核表达肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人热休克蛋白70（HSP70）的融合基因。方法： 采用加端PCR方法， 将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端； 将融合基因克隆入原核表达载体pET28a（+）中， 构建重组质粒pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70。经限制性内切酶BamH I、 Xho I双酶切鉴定及序列测定后， 转化E.coli BL21（DE3）， 经IPTG诱导表达融合蛋白， SDSPAGE检测表达结果。结果： 应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段， 序列测定结果证实， EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端。经BamH I、 Xho I酶切鉴定证实， 融合基因成功地克隆到原核表达载体pET28a（+）上； 转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导后， SDSPAGE分析发现在相对分子质量（Mr）约72000处有表达量明显增多的蛋白条带。结论： 成功地构建并表达了肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70的融合基因。 关键字：肝肿瘤/免疫学抗原肿瘤/遗传学表位热休克蛋白类70/遗传学基因表达 原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶性疾病之一。近几十年来， 尽管诊疗手段有了很大的进步， 但肝癌的预后并没有得到显著改善。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一， 尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。我们应用弱酸洗脱质谱法首次从肝癌细胞系中成功分离了MAGE1编码的由HLAB7提呈的肝癌抗原肽EPVTKAEML， 将其负载DC细胞， 在体外及裸鼠体内均可诱导抗肝癌特异性免疫反应[1， 2]。为加强EPVTKAEML的免疫原性， 选择具有诱导抗肿瘤免疫作用的HSP70为载体， 制备了EPVTKAEML与HSP70的融合蛋白， 为进一步观察融合蛋白能否诱导产生肝癌抗原肽特异性CTL， 寻求更有效的抗肝癌抗原肽疫苗奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 菌种E.coli BL21（DE3）由本室保存。原核表达载体pET28a（+）、 含HSP70基因全长片段的质粒 pCDNA3.1（+）/HSP70 （本校病理学教研室惠赠）， B型质粒小样快速提取试剂盒和B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒（北京博大泰克公司）， Pyrobest DNA聚合酶、 T4连接酶、 限制性内切酶（TaKaRa公司）。 1.2 方法 1.2.1 用加端PCR方法构建EPVTKAEML与HSP70的融合基因 根据HSP70基因的核苷酸序列， 结合引物设计的原则， 设计引物， 在下游引物的5′端加入EPVTKAEML的核苷酸序列（共27个碱基）， 并在引物两端分别加入BamH I及Xho I酶切位点， 引物在上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物： 5′CGG GAT CCA TGG CCA AAG CCG CGG CG3′， 下游引物： 5′CGA CTC GAG TTA CAG CAT TTC AGC TTT GGT AAC CGG TTC ATC TAC CTC CTC AAT GGT GGG3′。此序列中2处下划线部分分别为BamH I和Xho I， 黑体（加粗）部分是肝癌抗原肽EPVTKAEML。反应条件为： 94℃预变性5 min， 94℃ 变性1 min， 58℃退火50 s， 72℃延伸3 min， 循环1次； 94℃变性1 min， 68℃退火及延伸3 min， 循环28次， 另加72℃延伸7 min， PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收。 1.2.2 重组质粒pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70的构建 用BamH I和EcoR I双酶切PCR扩增的融合基因EPVTKAEMLHSP70和表达载体pET28a（+）， 进行琼脂糖凝胶电泳。分别回收目的片段和表达载体， 以T4 DNA连接酶于16℃连接16 h， 转化感受态E.coli BL21（DE3）。卡那平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒， 以BamH I和EcoR I酶切和DNA序列分析鉴定阳性克隆。 1.2.3 融合基因EPVTKAEMLHSP70的诱导表达 将含pET28a（+）/EPVTKAEMLHSP70质粒的E.coli BL21（DE3）接种于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培养液中， 37℃震荡培养至A≈0.5， 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L， 继续培养3 h取出， 离心收菌， 加入SDSPAGE上样缓冲液， 混匀， 煮沸5 min， 12000 r/min离心10 min， 取上清做SDSPAG