贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌筛选和鉴定.docVIP

贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌筛选和鉴定 　　摘要： 白苞蒿Artemisia lactiflora是一种重要的药用植物。对已分离获得的54株白苞蒿内生真菌粗提物分别采用MTT法和DPPH法进行体外抗肿瘤和抗氧化活性筛选，并采用分子生物学方法对筛选出的活性内生真菌进行鉴定。结果显示，共计10株（18.5%）白苞蒿内生真菌粗提物对人骨髓白血病细胞系（HL-60）、人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人前列腺癌细胞系（PC-3）生长的抑制活性较好，其中以链格孢属GYBH47菌株粗提物的抗肿瘤活性最佳，对3种肿瘤细胞株的生长均有抑制作用；共计2株（3.7%）白苞蒿内生真菌粗提物的抗氧化活性较好，其中，拟茎点霉属GYBH42菌株粗提物同时具有抗氧化活性和细胞毒活性。表明贵州白苞蒿内生真菌是寻找有价值的生物活性成分的潜在资源，其生物活性成分值得进一步研究和开发。 关键词： 白苞蒿；内生真菌；细胞毒活性；抗氧化活性；分子鉴定 [收稿日期] 2013-07-22 [基金项目] 贵阳市社会发展与民生科技计划项目（筑科合同[2012103]67号）；贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY[2013]3042号、黔科合NY[2013]3044号）；贵州省科技厅国际合作项目（黔科合外G字[2012]7006号）；贵州省科技创新人才团队建设项目（黔科合人才团队[2012]4007号）。 [通信作者] 康冀川，教授，博士生导师，主要研究方向为药用生物资源的研究与开发，Tel：（0851）8298675，E-mail：bcec.jckang@ [作者简介] 钱一鑫，助理研究员，硕士，主要研究方向为药用生物资源与活性研究，Tel：（0851）8298735，E-mail：qianyixin@ 白苞蒿Artemisia lactiflora Wall. ex DC.又名白花蒿、白米蒿、红姨妈菜等[1]，为菊科蒿属多年生草本植物[2]，主要分布于华中及西南各省区[3]。作为民族民间所广泛使用的一种中草药，白苞蒿已被《中国药典》2010 年版一部所收载，是中药刘寄奴的基原植物之一，具有清热、解毒、止咳、消炎、活血、散瘀、通经等功效，用于肝、肾疾病和血丝虫病的治疗[4]。近年来，植物内生真菌（endophytic fungi）次生代谢产物的研究发展迅速，已分离得到生物碱、甾体、萜类、醌类、木脂素等多种结构的化合物，且多具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等生物活性[5]。因此，利用药用植物内生真菌开发新药源具有极大的可能性。目前，对白苞蒿内生真菌的研究国内外尚未见报道。作者已从贵州白苞蒿的根、茎、叶中分离得到54株内生真菌，本研究对上述内生真菌的抗肿瘤和抗氧化活性进行了初步的筛选，同时对具有生物活性的菌株进行了分类鉴定，为进一步研究菌株中的生物活性成分奠定了基础。 1 材料 1.1 内生真菌 贵州白苞蒿内生真菌54株，由本实验室分别自贵州省贵阳、毕节和威宁地区白苞蒿的根、茎和叶中分离获得，保存于贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心药用真菌实验室。 1.2 肿瘤细胞 HL-60（人白血病细胞）、MCF-7（人乳腺癌细胞）和COLO205（人结肠癌细胞）均购于南京凯基生物技术有限公司。 1.3 试剂试药 阿霉素购于美国Sigma公司，DPPH自由基购于日本和光纯株式会社，Vit E购于中国食品药品检定研究院，真菌基因组DNA快速抽提试剂盒、Master Mix、异丙醇和真菌5.8S rDNA通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）均购于生工生物工程（上海）有限公司。乙酸乙酯（EtOAc）、二甲基亚砜（DMSO）、乙醇等试剂购于贵州鼎国生物技术有限公司，均为分析纯。 1.4 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于活化菌种；马铃薯葡萄糖液体（PDB）培养基用于培养种子液；查氏（Czapek′s）培养基用于菌株鉴定；肿瘤细胞株采用RPMI 1640培养，使用前加入10%胎牛血清。 1.5 仪器 HYG-A恒温摇床（上海太仓）、RE-520A旋转蒸发仪（上海亚荣）、HRCJ-1S超净工作台（青岛海尔）、UV-2550紫外-可见分光光度计（日本岛津）、TS-100F倒置显微镜（日本尼康）、HF212UV型CO2培养箱（香港力康）、YXQ-LS-75S蒸汽灭菌器（上海博讯）、CX41型光学显微镜（OLYMPUS公司）、T100型PCR仪（BIO-RAD公司）等。 2 方法 2.1 内生真菌粗提物的制备 将试管斜面保存的内生真菌菌种经PDA培养基活化后，切取黄豆粒大小的菌丝块，接种于250 mLL-1的三角瓶PDB培养基中，室温，16