转染技术在以丝素蛋白―壳聚糖―磷酸三钙为支架复合材料中应用.docVIP

转染技术在以丝素蛋白―壳聚糖―磷酸三钙为支架复合材料中应用 　　【摘要】 目的 构建含有病毒载体质粒的基因，用重组慢病毒感染[1]犬牙周膜细胞（Dog periodontal ligament cells，DPDLCs），初步探讨转染基因修饰种子细胞用于以丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙为支架的复合材料牙周组织工程修复的可行性。方法 通过RT-PCR检测DPDLC中病毒基因的表达。并以转染牙周膜细胞为种子细胞，修复犬下颌骨缺损。结果 转染后的牙周膜细胞为种子细胞的骨修复效果要比未转染的牙周膜细胞效果明显。结论 成功重组慢病毒可感染牙周膜细胞。并且转染后的牙周膜细胞为种子细胞的骨修复效果优于未转染的牙周膜种子细胞。 【关键词】 转染技术；丝素蛋白；牙周组织工程；支架材料 牙周组织工程是将体外培养的高浓度的种子细胞种植于具有良好生物相容性和降解的支架材料上，并由生长因子介入，经过特定的培养，植入机体病损部位，实现牙周组织的功能再生[2]。 目前，牙周组织工程的首选是种子细胞是具有多向分化潜能的牙周组织前体细胞-牙周膜细胞。而适宜支架材料的选择仍是研究的热点。结合当前组织工程支架材料的研究热点与本课题组近年来在组织工程与牙周病治疗方面的研究实践，本课题应用转染种子细胞-牙周膜细胞拟构建一种新型的牙周组织支架―壳聚糖―丝素蛋白―磷酸三钙多孔复合体。在复合支架内使用转染后的种子细胞从而达到最为理想支架的性能要求。 1 材料及方法 1.1 实验动物 1-2龄比格犬2只，体重15kg，雌雄不限（由山西医科大学动物实验中心提供）。 1.2 实验材料及仪器 壳聚糖-磷酸三钙（孔径150-200nm，孔隙率90%）；丝素蛋白粉末（湖州新天丝生物技术有限公司）；狗牙周膜细胞（山西医科大学动物实验中心提供）；DMEM/F12培养基；胰蛋白酶；胎牛血清；万分之一天平（TN托盘式扭力天平，上海第二天平仪器厂），COz恒温培养箱；倒置相差光学显微镜（BH-2Olympus显微镜，日本）；细胞计数板。 1.3 丝素蛋白-磷酸三钙-壳聚糖多孔复合材料的制备 在50mL的聚丙烯离心管中加入30-40mL1.5c2SBF和1.5Tas2SBF，将再生丝素蛋多孔材料浸渍在模拟体液中并在37摄氏度下恒温1-4周，制备丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合材料。 1.4 细胞培养 1.4.1 比格犬牙周膜细胞提取 将比格犬麻醉后静置5分钟，用75%酒精泡口腔2-3秒钟，再用碘酒消毒口腔，置比格犬带入超净台内。 用小刀从牙根周部慢慢刮取牙周膜，将牙周膜转移到另一装有PBS的平皿中，用手术剪将其剪成小块（1mm3），再用PBS液洗三次，转移至小青霉素瓶。将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。37℃静置3-5小时，轻轻转动培养瓶，使组织移入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养]。 1.4.2 牙周膜细胞传代及提取 一周后，原代细胞开始繁殖，本实验取第4代细胞为种子细胞。 1.5 转染细胞的培养 1.5.1 慢病毒的制备 在2个1.5ml的EP管中混合下列溶液：a管，按照4：3：2混合重组载体质粒FUGW或FUAmW，包装质粒CMV△R8.2，包膜质粒VSV-G，2×HEPES溶液；b管，PEI溶液，2×HEPES溶液。将a、b管混合后，加入DMEM培养液中培养2-4h换液，36-48h收集病毒上清。 1.5.2 感染后PDLC hAm 基因表达 转染72h后，倒置显微镜下可见293T细胞及PDLCs细胞生长密集相同视野荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光。 2 实验过程 2.1 本实验分三组进行。在两只比格犬上进行研究。 2.1.1 实验组 以转染后的牙周膜细胞为种子细胞植入丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架中。 2.1.2 对照组（一） 以比格犬第4代牙周细胞为种子细胞植入丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架中。 2.1.3 对照组（二） 单纯以丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架为骨修复材料。 2.2 犬牙周水平缺损模型建立 在比格犬下颌右侧制造骨缺损模型：把比格犬麻醉后，对其进行口腔内消毒，带入无菌室内。对其进行下颌右侧翻瓣手术。先检验麻醉是否到位，用手术刀在比格犬下颌右侧从2的位置下方切开一个约10cmX5cm的创口，用剥离器把粘膜组织充分剥离，充分暴露下颌骨区域，用高速手机在三个部位上取下三块狗自体骨大小约0.5cm×1cm×0.5cm。位置约为2-4，3-5，4-6，前后呈梯队排列，使之人为形成骨缺损。不宜离太近，是缺损区域至少有5mm的间隔，防止在骨愈合时形成融合，不易于观察。 2.3 植入三组丝素蛋白-壳聚