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不同产地大豆SOD的提取及活性比较 　　摘要：指出了超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，作为超氧阴离子自由基的专一清除剂，在疾病的治疗、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用。以大豆为实验材料，对其中的SOD酶提取流程进行了优化，然后利用改良的邻苯三酚自氧化法测定了所提取的SOD酶的活性，建立了最适合大豆的SOD酶提取流程。最后对九个不同产地大豆SOD酶活性进行了比较，结果显示：来自黑龙江的大豆酶活力最高，适合大规模生产。 　　关键词：超氧化物歧化酶；改良的邻苯三酚自氧化法；大豆 　　中图分类号：Q554.6 　　文献标识码：A文章编号2017）8023204 　　1引言 　　SOD是生物体内一种非常重要的金属酶，广泛存在于各种生物体中。同时也是一种重要的抗氧化剂，它的作用底物是超氧阴离子?O2-，催化超氧阴离子发生歧化反应，从而清除?O2-自由基[1，2]。目前SOD已在多个领域中被应用，比如医疗保健[3]、食品工业[4]、以及植物抗逆[5]等。植物来源SOD的分离纯化[6～8]主要工艺流程为：植物-精制-超滤浓缩-冷冻干燥-产品。SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法[9-11]。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶法、细胞色素法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。邻苯三酚自氧化法的主要原理为：在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，并产生?O2，在SOD存在下，自氧化反应受到抑制。该法所用试剂和仪器比较普通，测试方便，灵敏度高，是目前应用最广泛的一种测试方法，但对温度、pH值、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感，因此测定时要严格控制这些因素[12～14]。 　　笔者提取了大豆中的SOD酶，然后利用改良的邻苯三酚自氧化法对大豆的SOD酶活性进行了测定，对测定过程中的各个条件进行了探索，建立了大豆SOD酶测定最佳方法，并对不同产地大豆的SOD活性进行了比较，使SOD在规模化生产的同时更具针对性。 　　2材料与方法 　　2.1材料和仪器 　　本实验所使用的大豆样品来源于9个产地，分别为：广东（广州）、北京、江苏（动台）、黑龙江（佳木斯）、黑龙江（牡丹江）、福建（厦门）、广西（柳州）、湖北（武汉）、湖南（长沙）。对应的编号分别为1～9。 　　实验材料：Tris base（国药集团化学试剂有限公司，优级纯）；其余试剂均为分析纯。A液：称取1.2114 g Tris和37.2 mg EDTA?2Na溶于62.4 mL 0.1 mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。B液：4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。 　　实验仪器：紫外可见分光光度计（UEG1008016，上海美谱达仪器有限公司）；微型酸度计（PHSJ-3F，上海精科）；高速离心机（TGL-20M，长沙平凡仪器仪表有限公司）；超纯水系统（Aquaplore3S，颐洋企业发展有限公司）。 　　2.2SOD酶提取与处理 　　2.2.1粗酶液的提取 　　将大豆种子洗净淋干，于pH值为7.8的PBS缓冲液中浸泡10 h。清洗后加入4℃三倍体积的预冷缓冲液，在冰上匀浆。匀浆后加入一定量的缓冲液，在超声波清洗机中超声，使细胞破碎，得到粗酶液。 　　2.2.2SOD粗酶液的处理 　　热变性：分别取一定体积的粗酶液，放入60℃的水浴锅中分别保温10、15、20 min，在5000 r/min、4℃的离心条件下离心15 min去除沉淀，测定上清液中酶活力及蛋白含量，筛选热变性的最佳时间。 　　丙酮沉淀：取一定体积的酶液，置于冰浴中，缓慢加入-20℃预冷的丙酮，搅拌10 min，4℃下静置5 h，待其自然沉淀后， 4℃、5000 r/min离心15 min弃去上清液，收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，4℃、5000 r/min离心15 min后测定上清液酶活力和蛋白含量。 　　2.3酶活性与浓度的测定 　　2.3.1酶活力的测定 　　邻苯三酚自氧化速率测定严格控制在25℃进行。于15 mL比色管中用微量移液器依次加入A液2.35 mL，蒸馏水2.015 mL，B液0.35 mL。加入B液后立即混合并倾入比色皿，于325 nm处测吸光值，共测4次，即取开始后30s和90s时的吸光值，二者之差即为邻苯三酚自氧化速率△A325。本试验确定△A325值为0.060。测定样液和SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率时样品的加入顺序如表1所示，分别加入一定量样液或酶液使邻苯三酚自氧化速率约为0.5倍A325，即△A′325为0.030。 　　2.3.2蛋白质浓度的测定 　　采用紫外分光光度