农杆菌介导microRNA1510a基因转化大豆初步探究.docVIP

农杆菌介导microRNA1510a基因转化大豆初步探究 　　摘 要：MicroRNA（miRNA）是生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA， 并被证明在植物抵抗生物和非生物胁迫中起着重要作用。MiRNA1510a是课题组前期从大豆逆境胁迫miRNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA。本研究在构建miRNA1510a表达载体基础上，以大豆品种吉育72为材料，利用农杆菌介导的子叶节遗传转化法将miRNA1510a基因转入大豆中。通过PCR检测，最终确定有3株阳性植株，转化率为1.5%。该结果表明miRNA1510a基因已成功转入大豆，为进一步分析miRNA1510a调控大豆抗逆的分子机制奠定了基础。 关键词：大豆；miRNA1510a基因；农杆菌介导法；PCR检测 中图分类号：S565.1 文献标识码：A 1 前 言 1.1 大豆的概述 大豆，是最重要的高蛋白油料经济作物之一，但大面积盐碱、干旱土地的存在严重影响到人类对大豆这种农业经济作物的需求。所以利用基因工程手段改良大豆的耐盐碱、干旱性状，达到利用盐碱、干旱土地的目的已经成为当前研究热点。 1.2 microRNAs的概述 MicroRNA（miRNA）是一类在生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA，长度约为21～24nt。 1.3 植物遗传转化方法 现代生物技术的研究和发展为通过基因工程改良植物品系提供了必要的前提，目前应用于大豆遗传转化的方法主要有基因枪转化法、农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导转化（瞬时转染）、脂质体介导原生质体转化等[1]。其中应用的最广泛的是基因枪法和农杆菌介导法[2]。农杆菌介导的遗传转化方法，是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性从而把外援基因导入植物基因组的方法。因为其拷贝数低，整合完整，遗传比较稳定，受目的基因分子量的影响较小以及操作简便，广泛的应用于植物的遗传转化[3-4]。 2 实验材料和方法 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料选择 大豆品种为吉育72。 2.1.2 酶与化学试剂 DNA Marker 购自TaKaRa公司，根癌农杆菌EHA105由本实验室自己提供。 2.2 实验方法 2.2.1 农杆菌介导miRNA1510a基因转化大豆 2.2.1.1大豆转化具体过程 无菌受体制备：用吉育72大豆种子用次氯酸钠与盐酸 进行过夜灭菌消毒处理。 种子萌发培养：将灭菌消毒好的大豆无菌外植体放置于装有无菌水的玻璃器皿中浸泡20～30min，放入无菌培养皿中备用。暗培养3～7d。 农杆菌侵染子叶节 a 农杆菌的培养：取出保好的菌液10～15?l，加入50m1 YEP液体培养基中，放置于28℃，180rpm摇床，过夜培养。将菌液加入到50ml离心管中，置于离心机中4500rpm，离心20min，倒掉滤液，保留沉淀，用共培养液体培养基溶解沉淀，用于转化。 b 农杆菌侵染及子叶节转化：用灭菌后的刀和镊子将萌发充分的大豆外植体切开，在下方接近生长点处垂直于外植体边缘轻轻划几下，外植体在远离生长点去弃去1/3备用。将切好的外植体倒入分装好的农杆菌液体中，侵染20～30min。 共培养：取出侵入农杆菌的大豆外植体，放置于装有无菌滤纸的平板上，吸干多余附着的农杆菌。将共培养培养基上放入无菌滤纸，然后用灭菌后的镊子将大豆外植体生长点附近划有刀口的一面朝下，放置于无菌滤纸上，封口，暗培养2～3d。 生芽及芽伸长培养：共培养2～3d后，在超净工作台中，用灭菌后的镊子取出大豆外植体，将生长点附近划有刀口处朝下，45°角倾斜将外植体插入加有10mg/L的BASTA和500mg/L的头孢霉素的生芽培养基中，封口，光照培养待生长点处长出子叶。观察在含有BASTA的生芽培养基中，存活下来的植株，就是具有抗BASTA抗性植株。 生根培养：等到外植体生长点处的真叶完全长成，不定芽长至1cm以上时，可以将生芽培养的外植体转移到生根培养基中，放置于24℃/20℃16h光照的环境中培养15d左右，待长出不定根。 炼苗及移栽：待再生植株根系计较发达时，从培养基中将其拿出，移栽到灭菌后的蛭石和土壤的混合土花盆中，若获得转基因植株，可用于后续的分析实验。 2.2.2转基因大豆初步检测 提取转基因大豆基因组DNA，进行PCR检测，PCR扩增产物用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，初步确定miRNA1510a基因已转入大豆中。 2.2.2.1大豆基因组DNA的提取 利用 TPS法快速提取植物DNA：剪取新鲜大豆叶片2 cm，放入1.5ml的离心管中，加入400?l