白藜芦醇对L6细胞葡萄糖转运功能和生长周期信号蛋白调控.docVIP

白藜芦醇对L6细胞葡萄糖转运功能和生长周期信号蛋白调控 　　【摘 要】目的：研究白藜芦醇（resveratrol， RSV）对于肌肉细胞葡萄糖营养摄取和生长的细胞信号过程作用，以探讨其对抗肌肉萎缩的潜在细胞机理。方法：采用分化成熟的L6骨骼肌细胞给予RSV预处理（18h），然后进行胰岛素短时刺激葡萄糖摄取及蛋白印迹实验（Western Blot， WB）。结果：RSV 预处理可明显增强胰岛素刺激的L6细胞葡萄糖摄取，而特异的SIRT1去乙酰化酶抑制剂sirtinol并不影响细胞的葡萄糖摄取功能；相应地，RSV增加细胞的葡萄糖转运蛋白-4（glucose transporter-4，GLUT-4）蛋白含量，但对胰岛素刺激的蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）磷酸化并无影响；此外，RSV降低阻抑细胞周期循环的p21调控蛋白含量而对凋亡蛋白Bax的含量无影响，而给予尼克酰胺（NAM）则可反转RSV对p21的抑制作用。结论：RSV可通过增加L6细胞GLUT4蛋白含量促进细胞的葡萄糖营养摄取，但这一功能并不依赖于其经典的调控靶标SIRT1；另一方面，RSV可通过SIRT1减少阻抑p21的蛋白表达。因此，RSV可促进重要的营养物葡萄糖摄取，并影响细胞增殖循环过程起到对肌肉的促生长和增生作用。 【关键词】 白藜芦醇；葡萄糖摄取；GLUT-4；细胞周期；肌肉细胞 【中图分类号】R285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0021-02 白藜芦醇（RSV）等天然植物化学物不仅延缓衰老，对肌肉萎缩也有治疗作用[1， 2]。此外，RSV对其它现代流行疾病，如胰岛素抵抗引发的一系列心脑血管疾病，包括中风和老年痴呆也具有明确防治作用[3， 4]。RSV抗衰老机制研究起初鉴定到的作用靶标是SIRT1，后者被认为是介导热卡限制对抗衰老的关键信号蛋白[4]。随后的研究发现，RSV对SIRT1的激活需要AMPK介导。最近一项的研究发现，cAMP是介导RSV对AMPK调控的主要信号分子[4]。此外，Nrf2和雌激素受体等抗应激和细胞保护系统也参与RVS的药效作用[5， 6]。因此，RSV很可能是通过多靶点的信号机制联合起到抗衰老和防病作用。 RSV防治衰老过程和肌肉废用所导致的功能障碍与其对抗肌肉萎缩的药理作用有密切关系，但具体作用机理仍需进一步研究阐明。为了探讨RSV防治肌肉萎缩的细胞分子机理，本工作在培养的大鼠肌肉细胞给予RSV预处理，然后对葡萄糖摄取功能及相关信号调控进行了详细研究，并对细胞循环调控蛋白及凋亡信号用WB方法进行了初步探讨 1 材料与方法 1.1材料与试剂 大鼠骨骼肌L6细胞购自ATCC公司。α-MEM细胞培养基购自Gibco公司。[3H]-2-脱氧葡萄糖（Amersham）。RSV，尼克酰胺（nicotinimide， NM）购自Sigma公司，GLUT4和GLUT1抗体（Abcam及Calbiochem公司）、p21、p27、PKB、PKBSer473、P70S6K、p-P70S6K，p38、p-p38、JNK、p-JNK及Bax抗体（Cell Signaling），辣根过氧化物酶二抗（美国Santa Cruz公司）。Sirtinol购自Calbiochem公司。BCA蛋白浓度测定盒购自上海碧云天生物技术有限公司。胰岛素购于诺和诺德公司。 1.2 L6细胞培养和处理 L6大鼠成骨骼肌细胞以含10%胎牛血清的α-MEM培养基加1%青链霉素，在37℃及5%CO2的培养箱内进行培养。细胞分化参照已报道的方法[7]。细胞分化后在无血清培养下，给予100 μmol/L RSV处理18h。 1.3 葡萄糖摄取 实验按照报道的方法进行[8]。样品放射性采用beta 液闪计数器计数，并以样品蛋白浓度进行校正。以空白对照孔的葡萄糖摄取放射性数值为1计算计算。 1.4 蛋白印迹（WB） WB方法按作者报道的方法进行[9]。 1.5 统计学分析 图中数据以均数±SE表示，组间差异以方差分析进行，*代表P，我们进一步利用WB方法分别研究了PKB的激活和葡萄糖转运蛋白水平。结果显示，短时胰岛素处理明显增强PKBSer473及下游蛋白p70S6KThr389的磷酸化，而RSV并不加强胰岛素的这些作用（图2）。此外，sirtinol处理也对PKB的活化没有影响。而对参与L6细胞葡萄糖转运的两种蛋白，即GLUT4和GLUT1的蛋白含量的检测表明， RSV能明显增加细胞GLUT4蛋白含量（图2），而对GLUT1蛋白含量则无这一作用（资料未显示）。 2.3 RSV对细胞增生作用 RSV可活跃参与细胞凋亡及周期循环的调控[10]，而p21和p27是细胞增殖周期循环的重要抑制性因