2009生物技术综合实验（中山大学）课件一.ppt

第二单元cDNA的TA克隆重组质粒转化大肠杆菌提取质粒、酶切鉴定插入片段 生化系 谭红铭 Lssthm@mail.sysu.edu.cn 实验的技术路线: 提取重组子质粒进行酶切鉴定。 重组子检测 Steps in cloning a gene 实验六 cDNA的TA克隆 PCR产物的回收 一、实验目的 学习和掌握DNA片段胶回收的方法 学习DNA连接的有关技术 二、实验原理 Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为T-A克隆, 它实际上是一种粘性末端连接, 因而具有较高的连接效率,可用于PCR产物的克隆和测序。 商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC18载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。 三、试剂与器材 〈一〉试剂 pMDTM18-T Simple Vector（TaKaRa） DNA凝胶回收试剂盒（Omega) 电泳缓冲液（1×TAE） 琼脂糖；溴酚兰；SYBR Green I* 2ul (SYBR Green I)+4ul (6×loading buffer) +20ul DNA 混合均匀后点样 (二)器材 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统 恒温水浴槽 移液器 四、操作步骤DNA片段的胶回收 电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行） Gel Extraction Protocol Omega Kit 1 把所割胶放入1.5mlEP管,称重。(预先称好空管重量)。 2 按1g/1ml 的量,加入Binding Buffer,55-65度水浴7min。（每隔2－3min，摇一下管） 3 把溶液加入spin-column,10000g离心1min，去残液。 4 在柱子中加入300ul Binding buffer 。10000g离心1min，去残液 5 在柱子中加入700ul的SPW溶液，放置2－3min，10000g离心1min，去残液。 6 10000g离心1min（去乙醇） 7把柱子放入干净的1.5mlEP管。加灭菌ddH2O 20ul。50度放置1mins。10000g，离心1min。 胶回收注意事项 将电泳槽倒入新鲜配制的电极缓冲液； 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶； 使用长波紫外光（365nm) 尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤； 熔胶要完全 。 实验七 感受态细胞的制备 和重组质粒的转化 一、实验目的 掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 二.原理 质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力,这种状态的细菌被称为感受态细菌。 CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42℃下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。 决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓度等。 三、试剂与器材 〈一〉试剂 LB液体（固体）培养基 LB/Amp/IPTG/X-Gal平板 IPTG储存液 X-gal储存液 (二)器材 37℃培养箱、水浴锅、恒温振荡器 分光光度计 离心机 微量移液器等 四、操作步骤 感受态细胞的制备 挑单个菌落接种到3 ml LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜（～12hr)。 取过夜培养物, 按1：50接种到50ml LB培养基中, 37℃振荡培养50分钟左右，直至培养液中细菌浓度达到OD600为0.2-0.4(细菌对数生长早中期，0.375)。 取1ml至1.5mL离心管中（三份），培养物冰上放置10