《动物寄生虫病学》许金俊-实验十二 动物寄生虫病的分子生物学诊断.docVIP

实验十二 动物寄生虫病的分子生物学诊断 一、实验目的和要求 本实验以弓形体病的PCR诊断为例介绍动物寄生虫病的分子生物学诊断方法，让学生了解动物寄生虫病的分子生物学PCR诊断方法的基本原理和操作步骤。 二、实验材料和仪器设备 1、弓形虫虫株：NT株（猪源汤山分离株）购自江苏省农科院，本实验室保存。 2、实验动物：ICR小鼠（18－22g），购自扬州大学比较医学中心。 3、NT株弓形虫DNA：人工感染NT株ICR小鼠腹水，按照酚－氯仿法提取DNA，分光光度计进行定量，分装后保存于-20℃。 4、试剂：蛋白酶K（上海Promega公司），dNTPs，Mgcl2，TaqDNA聚合酶，DL2000 Marker购自上海生物工程公司。Genome DNA Extraction Kit (code D9081)购自TaKaRa公司（大连）。其他常规试剂均为国产分析纯级，购自扬州市中林生化试剂有限公司。 5、引物：据Burg 等（1989）提供的B1基因设计并合成1对引物：上游引物P1：5’－GGAACTGCATCCGTTCATGAG－3’（694－714bp）和下游引物P2：5’－TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC－3’（887－868bp）。该引物扩增片断长度为194bp。 据J.T.Ellis等（1998）的报告设计并合成第2对引物，上游引物P3为5’－CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3’；下游引物为P4 5’－CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT -3’， PCR产物的长度529bp。 以上2对引物由大连宝生物公司合成。 6、仪器：PCR扩增仪，新加坡生产的PCR system 2400型和德国生产的T－Gradient Thermoblock；电泳仪，北京市六一仪器厂生产的DYY－2型稳压稳流电泳仪；凝胶数码成像系统，上海天能科技有限公司生产的Gis－2008型；冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂，TGL－16G－A型。 6、耗材：PCR管、琼脂糖、Tip头、冰盒等 7、试剂的配制 （1）PBS缓冲液(pH7.4)：在800 mL水中加入NaC18 g，KC0.2 g，NaHPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，以HCl调至7.4，加水定容至1 000 mL。 2）DNA提取液：10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1mol/L EDTA pH 8.0，0.5% SDS 3）TE缓冲液（TrisEDTA缓冲液）(pH 8.0)：10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mol/L EDTA 4）50 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)：称取9.30625g EDTA，加入40 mL双蒸水，加入NaOH (约1.3g) 使其pH 8.0，然后加入双蒸水，使其为50 mL。 5）0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)的配制：称取Tris 1.214 g，加入双蒸水，用浓HCl调整其pH 8.0。 6）无DNA酶的RNA酶的配制：将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/mL的浓度，于100℃加热15 min，缓慢冷却至室温，分装，保存于－20℃。 7）10%SDS的配制：在900 mL水中溶解100 g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓HCl调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1 000 mL，分装备用。 8）ACD抗凝液：柠檬酸0.84 g，柠檬酸钠1.32 g，葡萄糖1.47 g，加水至100 mL。 9）TAB缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，10 mmol/L KCl，2 mmol/L EDTA，4 mmol/L MgCl2 10）加样缓冲液：0.25 %溴酚蓝，0.25 %二甲苯青，15 %聚蔗糖，配制后室温保存。 11）饱和酚—氯仿—异戊醇（25：24：1）：饱和酚25份加氯仿24份加1份异戊醇。 12）氯仿－异戊醇（24：1）：氯仿24份加1份异戊醇。 活畜或屠宰动物腹水或者抗凝全血无菌采集待检样品，4 ℃保存待检。 μg／ml，55℃水浴2h，不时摇振。取出水浴中的指形管，加等体积饱和酚－氯仿－异戊醇，上下缓慢颠倒10次，室温下，12000rpm离心5min。吸取上层水相，置于另一指形管中，加入等体积氯仿－异戊醇，轻轻混匀，12000rpm离心5min。吸取上层液相，置于另一指形管中，加入等体积氯仿，轻轻混匀，12000rpm离心5min。吸取上层液相，置于另一指形管中，加入2倍体积的无水乙醇，置于－20℃ 15min以上，沉淀DNA。取出指形管，4℃下12000rpm离心2min。吸出