微生物检验教学课件（扬州大学）第九节 肉毒梭菌检验.pptVIP

第九节 肉毒梭菌检验（Clostridium botulinum） 肉毒梭菌在严格厌氧的条件下可产生极其强烈的外毒素。 该毒素性质稳定，不易被蛋白酶及酸破坏，人、畜多因食入此毒素的食品或饲料，而引起食物中毒。 1958年新疆发生发酵性豆制品食物中毒，首次证实了肉毒梭菌在我国的存在。在新疆、青海、宁夏和四川等多发地区的土壤中，该菌的检出率为22.2％，发酵食品中检出率为14.88％。 2007年9月15日 CCTV.com消息(午夜新闻)：卫生部14号晚发出紧急通知：警惕肉毒梭菌食物中毒事件。 ????经调查，在石家庄市乾丰食品有限公司、石家庄市东光食品厂、石家庄市独一家食品有限公司、定州市新宗食品有限公司、饶阳县健民食品厂生产的火腿肠中检测出肉毒毒素。河北省、山西省近日发生的肉毒梭菌食物中毒事件与这些产品有关。 引起肉毒中毒的食品大致类型 我国→主要是家庭自制的发酵食品，如豆瓣酱、豆浆、臭豆腐等。少数发生于各种不新鲜肉、蛋、鱼类食品。 日本→以鱼类制品引起中毒者较多。 美国→ 以家庭自制罐头和肉乳制品引起中毒者为多。 欧洲→ 多见于腊肠、火腿和保藏的肉类。 致病性 厌氧条件下可分泌强烈的外毒素——肉毒毒素。毒力是目前已知生物毒素中最强的一种，毒性比氰化钾强1万倍（1mg可致死2000万只小白鼠，人的致死量为1?g左右）； 根据肉毒毒素的抗原性，可将肉毒梭菌分为： A、B、C、D、E、F、G等7个型，其中C型还可分为Cα和Cβ两个亚型。 C型肉毒中毒多见于鸡及野禽，特别是水禽，且多因吃腐烂植物引起。 D性肉毒中毒多见于南非及美国得克萨斯州的牛有异癖者，常因吃已死动物的骨骼（动物死尸内曾有肉毒梭菌繁殖）。 此外，C、D型还见于马、绵羊、水貂饲料中毒。 其中A、B、E、F型肉毒梭菌中毒大多数报道见于食用发酵的豆类、肉及肉制品、鱼罐头、鱼罐头及生鱼等。 中毒机理 毒素经胃肠道进入血液，作用于神经及神经-肌肉接头处，以及植物神经末梢。阻碍了乙酰胆碱的释放，因而引起胆碱能神经支配的肌肉和骨骼肌麻痹，产生症状及死亡。 微生物学检验 肉毒梭菌中毒为毒素中毒，故从患者体内或残留食物中查出肉毒毒素是最有价值的，而肉毒梭菌的分离培养仅作为诊断的辅助手段。 对毒素的检测以动物试验方法开始较早，多种动物对肉毒毒素均很敏感，其中价格低廉且敏感性最高的是小白鼠。 肉毒毒素检测 明胶磷酸盐缓冲液 成分 明胶 2g 磷酸氢二钠 4g 蒸馏水 1000ml PH 6.2 液状检样可直接离心，固体或半固体检样须加适当明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。 另取一部分上清液，调pH6.2，每9份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混匀，不断轻轻搅动，37℃作用60min，进行检测。 检出试验 取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只0.5ml，观察4天。 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在24h内发病、死亡。 主要症状为竖毛、四肢瘫痪，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。 如遇小鼠猝死以及症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。 确证试验 不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成三份进行试验。 一份加等量多型混合肉毒毒素抗诊断血清，混匀，37℃，作用30min。 一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min。 三份混合样分别注射小白鼠各两只，每只0.5ml，观察4天，若注射加诊断血清与煮沸加热的两组混合物的小白鼠均获保护存活，而注射未经其它处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡，则可判定检样中的肉毒毒素存在。 定型试验 按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10 MLD/ml-1000 MLD/ml的范围，分别与各单型肉毒毒素抗诊断血清等量混合，37℃，30min，各注射小鼠2只，每只0.5ml，观察4天。 能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样所含肉毒毒素的型别 肉毒梭菌检出 取疱肉培养基三支，煮沸10?15 min，做如下处理： 急速冷却，接种检样均质液1?2 ml 冷却至60 ℃，接种检样，继续于60 ℃保温10 min，急速冷却。 接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。 以上接种物30℃培养5天，若无生长，可再培养10天。培养到期，若有生长，取培养物离心，以其上清液进行毒素检测试验，阳性结果证明检样中含有肉毒梭菌。 肝块肉汤 成分 牛肉膏 20g 酵母浸膏 4g 蛋白胨 4g 磷酸氢二钠 3g 可溶性淀粉 1g 蒸馏水 1000ml PH 8.0