细胞分子生物学（扬州大学）细胞分子生物学实验.docVIP

质粒DNA的小规模制备 课程名称：细胞分子生物学 实验学时： 3学时 一、实验目的 1．了解碱裂解法制备质粒DNA的基本原理； 2．掌握碱裂解法的具体操作方法和注意事项。 二、实验原理（或背景知识） 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、实验材料 （一）??仪器 1．微量移液器（20μL，200μL，1000μL） 2．恒温摇床 3．台式高速离心机 4．高压蒸汽灭菌锅 （二）?? 材料 1．含pUC18质粒的E.coli DH5α菌株 2．1.5m L eppendorf管及管架、tips 3．葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙酸钾、冰乙酸、乙醇、盐酸（HCl）、饱和酚、氯仿、?异戊醇、ddH2O （三）?? 试剂 1．LB液体培养基 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 溶于800mL ddH2O中，用10N NaOH?溶液调节pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压灭菌20分钟。 2．溶液I 50mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl 10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0） 3．溶液II 0.4mol/L NaOH， 2% SDS，用前等体积混合 4．溶液III 5mol/L乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL ddH2O 28.5mL 5．RNase A溶液 RNase A?溶于10mmol/L Tris·Cl（pH7.5）、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的溶液，100℃煮沸15min。 6．TE缓冲液 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 7．?70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） 8．氯仿溶液 氯仿∶异戊醇=24∶1(体积比) 四、实验内容 1．将菌种接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 2．取1.5ml培养物倒入Eppendorf管中，12000rpm离心30s。 3．吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4．将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。 5．加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上3min。 6．加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。 7．12000rpm，离心5min，将上清夜转至另一Eppendorf管中。 8．加入RNase A溶液2μL，37℃作用30min，去除RNA。 9．加入等体积饱和酚/氯仿溶液（约400mL），振荡混匀，12000rpm离心5min，小心移出上层水相于一新Eppendorf管中。 10．向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，-20℃放置10~15min。12000rpm离心10min。倒去上清夜，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 11．用1mL 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，离心，倒去上清夜，真空抽干或空气中干燥。 12．50μL TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。 五、讨论分析 1．实验操作过程中有哪些注意事项？ 2．质粒质量好坏与哪些操作步骤有关？ 六、成绩评定： 1．能认真预习实验内容，教师提问优秀者占总成绩20%。 2．动手能力好、能独立操作且操作正确占总成绩40%。 3．报告清晰、结果正确、并有一般讨论分析占总成绩 30% 。 4．讨论分析有参考文献、具有创新意识者占总成绩10% 。 DNA限制性酶切及电泳分析 课程名称：细胞分子生物学 实验学时： 3学时 一、实验目的 1．理解和掌握限制酶消化DNA的基本原理和方法； 2．掌握琼脂糖凝胶电泳的操作步骤、凝胶的染色及注意事项。 DNA限制性内切酶能特异切割某一核苷酸序列，从而形成5’磷酸基团和3’羟基的结构。而酶切后的线性DNA分子在琼