植物组织中总糖与还原糖的测定.pptVIP

实 验 一 植物组织中总糖及还原糖的测定 —3,5-二硝基水杨酸比色法 一、实验目的： 1、掌握还原糖与总糖测定的基本原理。 2、掌握比色法测定还原糖的操作方法。 二、实验原理: 1、还原糖：指含有游离的半缩醛(酮)基糖。 单糖都是还原糖；某些二糖是还原糖（如麦芽糖、乳糖等）；多糖为非还原糖。 2、总糖的提取及双、多糖的酸水解。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖与多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖与多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖与总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 2、还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应： 在碱性条件下，还原糖与DNS试剂反应，还原糖被氧化成糖酸及其它产物， DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 3、在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质(3-氨基-5-硝基水杨酸)颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。 由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、仪器与试剂： 1、实验材料：苹果（约0.5 g） 2、仪器：水浴锅；可见分光光度计等。 3、试剂： （1）1 mg/mL葡萄糖标准液 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂(碱性) （3）6M HCl与6M NaOH 四、实验步骤： 1、葡萄糖标准曲线的绘制: 取7支试管，按下表操作，以标准葡萄糖含量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 2、还原糖的提取 取0.5g样品于研钵中，加水2-3ml，充分研磨。 用2-3ml蒸馏水分三次冲洗研钵(总体积小于10 ml)，转入试管中。 在50℃水浴中恒温20分钟，冷却后于3000转离心5分钟。 取上清转入试管中，用蒸馏水定容20毫升，待测。 3、样品含糖量的测定: 取提取液1.0ml，按上表操作。 五、计算： 还原糖含量(μg/ g )= * 学时：3 3-氨基-5-硝基水杨酸 (棕红色,A540) 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 1、葡萄糖标准曲线的绘制 2、还原糖的提取 3、样品含糖量的测定: 0.114 光密度值 OD540nm 5min 冷却 沸水 浴 χ1 1.0ml 1000 0 1.0 5 800 0.2 0.8 4 600 0.4 0.6 3 400 0.6 0.4 2 200 0.8 0.2 1 0 1.0 1 0 0(参比溶液) 葡萄糖含 量（μg） DNS mL 蒸馏水 mL 葡萄糖 标准液 mL 管 号 还原糖提取液 蒸馏水 mL 4 还原糖含量χ1(μg) ×样液总体积 测定用样品液体积×样品鲜重(g) 总糖含量(μg/ g )= 水解后还原糖含量 (μg) ×样液总体积×0.9 测定用样品液体积×样品鲜重(g) 六、思考题： 1、何谓还原糖？ 2、本实验的注意事项?