针对CYP450介导的美托洛尔α-羟基化和O-去甲基化代谢通路的的分析研究.pdfVIP

摘要 摘要 背景： 压、心律失常等心血管疾病。体内研究表明，MET在肝脏经多条途径代谢， 其中65％的MET经0．去甲基化代谢通路代谢生成O．去甲基美托洛尔 介导O．去甲基化代谢通路，因此本课题围绕探讨在人体内除CYP2D6外，是 介导其n．羟基化和o．去甲基化代谢通路。 目的： 本论文拟采用肝微粒体体外孵育实验，系统研究在人肝微粒体中，参与 MET代谢过程及其0【．羟基化和O．去甲基化代谢通路的相关CYP450酶；同 基因型个体中体外代谢的差异及产生差异的分子机制；为更深入地研究其药 动学及其临床上合理用药提供理论和实验依据。 方法： 1、建立MET在人肝微粒体和人CYP3A4重组酶中的孵育方法以及样 方法，并参照生物样本分析要求进行全面的方法学验证。 2、MET在人肝微粒体试验中酶促动力学分析。实验设计如下：分为空 白组和试验组，孵育体系总体积为200此，实验组中加入NADP反应体系 5 10 2 mM)，空白组加入 60肛L(MgCl2mM，G-6-PmM，G一6-PDU，NADP十1 等量PBS，孵育体系中人肝微粒体蛋白终浓度为1m∥ml，每组分别加入系 列浓度的MET 品，采用HPLC．Flu检测法测定反应体系中MET及其活性代谢产物HM、 摘要 ODM浓度，比较MET及其代谢产物HM、0DM在人肝微粒体中的代谢动 活性代谢产物HM和ODM在人肝微粒体中的酶促动力学参数Vm孙Km、 Clint等。 3、CYP450酶抑制剂对MET在人肝微粒体中代谢速率及对活性代谢产 物HM和ODM生成速率的影响。实验分为实验组和对照组，实验组将终浓 度为40州的MET分别和各种CYP450酶专属抑制剂体外共同孵育。实验 1 —pyrazole，Sul)、CYP2C 5pM、DislO“M、Sul30“M、S-mep KTZ)各lO此，使其终浓度分别为0【-Nap 50uM、Qui5“M、Tro50“M、KTZ3“M，对照组用等量PBS代替抑制剂， 抑制程度用相对于对照组的MET代谢率、HM和0DM生成率来表示。 4、MET在野生型及不同位点突变型CYP3A4重组酶中体外酶促动力学 2U，NADP+ 5mM，G一6-P10mM，G一6一PD 加入NADP反应体系60此(MgCl2 1 mM)，空白组加入等量PBS，每组分别加入系列浓度的MET10此，NADPH 5 10 2 mM)，9阵 mM，G-6一PmM，G-6-PDU，NADP十1 反应体系60此(MgCl2 腈终止反应后处理样品，采用HPLC．Flu检测法测定反应体系中MET及其 活性代谢产物0DM在野生型和突变体CYP3A4重组酶中酶促动力学参数 Vm附Km、Clint等。 5、数据统计分析：所有数据均以平均数士标准差(me砒SD)表示，统 计数据分析方法采用SPSSl2．0软件进行数据处理，组间差异采用设计的t检 验，并利用相应统计图、表的形式将结果呈现，统计结果以PO．05为具有显 摘要 著性差异，以P0．01为具有极显著性差异。 结果： 1、成功建立在人肝微粒和人CYP3A4重组酶中MET的孵育方法以及 测方法，具有较高的灵敏度和专属性，方法学符合生物样本的分析要求。 肝微粒体浓度为lm∥ml。在5-40肛M底物浓度范围内，活性代谢产物HM和 00LLM ODM的生成量随底物浓度增加呈近似线性的增加，当MET浓度达到l 时，两者生成呈饱和状态，这些均表示MET在人肝微粒体中代谢符合典型 分别求得在人肝微粒体中MET代谢为HM和