转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究.pdfVIP

骨科 2010年第 1卷第 2期 · 65 · doi：10．3969／j．issrL1674—8573．2010．02．003 转 BMP一7基 因BMSCs复合 nHAC体外培养的实验研究 (03()001太原) 山西医科大学第一医院骨科 卢向东 郭庆华 刘 强 李 平 【摘要】 目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋 白一7(BMP_7)的骨髓基质干细胞 (BMS )，并与纳米羟基磷灰石胶原 (nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨 。方法 用慢病毒把人 BMP一7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大 鼠BMS ，用 G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养。荧光显微镜下观察 eGFP表达，判断感染效率； 以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力；RT—PCR、E1ISA检测 目的基因表达；碱性磷酸酶(AIP)活性检测成骨能力；扫描电镜观 察细胞在支架材料中的黏附、生长状况。结果 慢病毒 24h对BMSCs的转染率约为 9() ；MTT实验显示细胞活性较未转 染组无明显差异(PO．O5)；RT-PCR检测到BMP7表达 ，在 1300bp处出现特异性条带；EIISA检测 24hBMP-7蛋白含量 为(150．2±18．3)pg／ml；ALP活性以第 16天左右最强；扫描 电镜见细胞种植 nHAC支架后粘附、生长 良好。结论 BMP-7 可在BMSCs内稳定表达，并诱导其向成骨分化 ；与nHAC复合培养可构建组织工程骨。 【关键词】 骨髓基质干细胞 ；骨形态发生蛋 白一7；转染 Invitro co-cultureofBMs【Cstransfectedwithlentivirus-mediatedBM P-7genewithnHAC scaffold．LU Xiang-dong，GU0 Qng—hua，LJUQiang，eta1．Departmentof Orthopedics， eFirstHospital，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan 030001。 ina [Abstract] Objective Toestablishmodifiedbonemarrowstromalcells(BMSCs)whichcanexpressBMP-7stably；then BMSCswereplantedintothescaffoldofnano-hydroxyapatite／collagen(nHAC)materialtoconstructtissueengineeringbone． Methods BMP 7andeGFP genesweretransfectedintoBMSCsofSD ratsbyusinglentiviruses．Thepositiveclonieswerese— lectedbyusingG418andco-culturedinvitrowithnHAC scaffold．ThetransfectionefficiencyandproliferationofBMSCSwere measuredunderthefluorescencemicroscopyand MTT method，respectively．TheexpressionofBMP-7wasdetectedbyRT_ PCR andElISA．OsteogenousdifferentiationwastestedwithALPactivity．TheadhesionandgrowthofBMSCsonthenHAC scaffoldwereobservedunderthescanningelectronmicroscopy (SEM )．Results Thetransfectionefficiencywasabout90 in thefirst24h．Therewasnosignificantdifferenceinproliferationsbetweentransfeetedandnon-transfectedBMSCs(P0．05)． RT-PCR revealedthatBMP-7genewaslocatedat1300bpintransfectedgroupbutnotintheothergroups．ELISA confirmed theBMP7expressionwas(15()