改良抗酸染色原版.ppt

改良抗酸染色法检测脑脊液细胞内外结核杆菌 刘庆军 * * 死亡率高 (15％-30％) 致残率高 占结核病发病 10％-20％ 传统的涂片阳性率低 (0-20％) 结核杆菌培养时间长 研究背景 结 脑 T-spot The Xpert MTB/RIF System (Cepheid) 结核杀手卷土重来 据世界卫生组织报道，全球已有近1/3的人口已经感染了结核菌，每年新发生结核病人870万例，每年死于 结核病达200万例。全球目前有结核病病人2000万例。目前结核病的控制情况不容乐观 。 结核 杆菌 是胞 内寄 生菌 结核杆菌抑制吞噬溶酶体的成熟,逃避被溶酶体酶类杀灭 通过抗原提呈作用的衰减也有利于结核杆菌的生长 结核杆菌就能在巨噬细胞内持续存活和不断进化 急需建立检测胞内菌的染色方法 胞内寄生特点可能是结核耐药的原因之一 胞内结核菌的检测有利于对结核的诊断和病理机制的研究 传统的抗酸染色法只能检测胞外菌 提出问题 为什么脑脊液结核杆菌镜检阳性率低？ 分析原因 脑脊液结核菌收集方法有待改进 无法检测到胞内结核菌 解决方案 改良抗酸染色法的建立 传统抗酸染色 试管离心法 空白玻片 抗酸染料无法入胞 改良抗酸染色 玻片离心沉淀法 粘附剂处理玻片 抗酸染料易进入细胞 建立改良抗酸染色法 改良抗酸染色法步骤 0.5ml脑脊液加到玻片上,离心沉淀(50g,5-10min) 4%多聚甲醛固定15min 0.3% TritonX-100浸泡30min 石炭酸复红染色15min 酸性酒精脱色3min/次,2次 美蓝复染5min 脑脊液离心沉淀仪 结核杆菌形态 细长略弯曲，端极钝园，大小约1～4×0.4um ，呈单个或分枝状排列，形态也可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等 Triton 对结核杆菌荚膜的作用 结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜 荚膜的主要成分为多糖、部分脂质和蛋白质 Triton也会破坏荚膜 结核杆菌更容易着色 传统抗酸染色胞外菌检测阳性率：16.7% (8/48) 平均20±9.1阳性高倍视野 改良抗酸染色胞外菌检测阳性率：100% (48/48) 平均73.5±8.4阳性高倍视野 传统抗酸染色胞内菌检测阳性率： 0% (0/48) 改良抗酸染色胞内菌检测阳性率：93.8% (45/48) 平均24.3±22.0阳性高倍视野 传统与改良抗酸染色的比较 （来自29例确诊患者的48份CSF标本） 传统抗酸染色、结核菌培养及改良抗酸染色敏感性比较 结 论 二 三 应用改良抗酸染色法可有效地提高结核性脑膜炎患者的脑脊液中细胞内外结核杆菌的检出率 一 首次在结核性脑膜炎脑脊液中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞内检测到结核杆菌 改良抗酸染色法敏感性较传统的抗酸染色、结核菌培养法明显提高 制片时注意事项 玻片挂胶要干净，防止杂质粘附到玻片上 滴入沉淀器中CSF量要根据白细胞的数目定 离心时间的设定 阅片时注意事项 WHO规定阅1张片时间不能低于5分钟。 注意细菌形态，与杂质鉴别。 细胞内外AFB数量》4条，才能判定为阳性。 小结 观察细胞内外结核杆菌 尽可能多看到细胞内结核杆菌 也要注意何种细胞内存在结核杆菌 * * When analysed by patient, Sensitivity of culture and MZN was equal. While the sensitivity of CZN was 27.59% [95% C.I 9.29–35.89] (n=8/29) against culture and MZN. Specificity of all techniques was 100% (n =29/29). When analysed by sample, sensitivity of CZN was 22.86%[95% C.I 8.9–36.7] (n=8/35), 16.67% [95% C.I 11.29–22.05] (n=8/48) against culture and MZN respectively. Sensitivity of culture was 72.92%[95% C.I 66.51–79.33] (n=35/48) against MZN. Specificity of all techniques was 100% (n =48/48). * 结论： * * * * When analysed by patient, Sensitivity of culture and MZN was equal. W