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第二章 菌种的保藏与复壮 菌种衰退的基本原因是变异，变异是不可避免的，而减缓变异速度则是可能的。变异速度与菌种所处的环境有密切的关系，不良环境条件能促进变异，频繁或过多传代也是造成衰退变异的重要原因。为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退，这就是菌种保藏与复壮工作。 第二章 菌种的保藏与复壮 一、菌种保藏 ? 二、菌种的提纯与复壮 一、菌种保藏 工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要求有所不同。工业微生物菌种保藏，是要使菌种生产能力和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，当然做不到绝对不变，只是力求把这种衰退现象推迟减缓到最低限度。 菌种保藏 菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养物质等，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。 菌种保藏 其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。 一、菌种保藏 (一)低温保藏法 (二)低温定期移植法 (三)石蜡油低温保藏法 (四)干燥保藏 (五)甘油管保藏法 (六)真空冷冻干燥法 (七)液氮超低温保存 (一)低温保藏法 这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4℃冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不超过1～2个月为宜。本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。 (二)低温定期移植法 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。 (二)低温定期移植法 斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，即容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。 (三)石蜡油低温保藏法 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4～4℃下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。 (三)石蜡油低温保藏法 具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。 (四)干燥保藏 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。 1.沙土管法 取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞121℃灭菌1h，也可用170℃2h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(≥106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.3～0.5ml，用接种环将其混合均匀。 1.沙土管法 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽