结核分枝杆菌FtsZ抑制剂的筛选和活性研究.docxVIP

结核分枝杆菌 FtsZ 抑制剂的筛选和活性研究林媛，朱宁屿，蒋建东，司书毅【摘要】目的 筛选结核分枝杆菌 FtsZ 的特异性抑制剂，为抗结核药物的研发提供先导化合物。方法 应用本实验室已经建立的结核分枝杆菌 FtsZ 抑制 剂筛选模型对化合物库进行筛选，获得能够抑制 FtsZ 的化 合物 202E，对其进行 IC50 以及分子水平活性测定，并利 用 DS 4.0 软件将化合物 202E 与 FtsZ 的活性位点进行 对接。结果 化合物 202E 能够抑制结核分枝杆菌 FtsZ 的 GTP 酶活性，其 IC50 为 15.46 μmol/L。202E 还能够抑制 FtsZ 蛋白的聚合。通过分子对接，发现 202E 能够与 FtsZ 的 GTP 结合位点结合，抑制 FtsZ 的 GTP 酶活性。结论 化合物 202E 是活性较好的结核分枝杆菌 FtsZ 抑 制剂。【关键词】 结核分枝杆菌； 酶抑制剂； FtsZ此，FtsZ 被认为是一个很好的抗结核药物研究靶点[5-6]。本研究以 FtsZ 为靶点，利用前期工作中建立 的结核分枝杆菌 FtsZ 抑制剂筛选模型[7]，对国家 新药（微生物）筛选实验室化合物库进行筛选，寻 找到结构新颖的抗结核先导化合物，为抗结核药物 的研发奠定基础。1材料与方法1.1 材料1.1.1菌株 带有 FtsZ 基因 的表达工程 菌pET16b-FtsZ（BL21）由本室构建；耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）mc2155 购自美国标准 生物品收藏中心（ATCC）。1.1.2 试剂与培养基 孔雀绿、GTP、DMSO 购 自美国 Sigma 公司；30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶 液、4 × 分离胶缓冲液、4 × 浓缩胶缓冲液、R-250 考马斯亮蓝染色液购自北京普利莱基因技术有限 公司；7H9 培养基、ADC 增菌液购自美国 BD 公 司；化合物 202E 购自北京百灵威科技有限公司； 筛选所用化合物库来自国家新药（微生物）筛选实 验室，纯度 95%。/中国医药生物技术, 2015, 10(2):109-112结核病近年来在全球范围有卷土重来的趋势，主要原因是多重耐药结核杆菌（MDR）的出现以及 结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒（HIV）的联合 感染。在过去的几十年中，几乎没有新型高效的抗结核药物被研发出来[1] 。直到2012 年底，美国1.1.3仪器 EnVision2014 型酶 标仪为美国 FDA 批准二芳基喹啉上市，虽然其具有抗结核活性，但是体内毒性较大[2]。因此，寻找新的有效的 抗结核药物成为我国乃至世界结核病防治的重要 任务。PerkinElmer 公司产品。1.1.4 对接软件 Discovery Studio（DS）4.0 购 自美国 Accelrys 公司。1.2 方法1.2.1 耻垢分枝杆菌对化合物库进行初筛 由于 结核分枝杆菌生长速度过慢，无法满足大量的体外 筛选要求，因此我们选择与结核分枝杆菌高度同源细菌结构蛋白FtsZ 是真核细胞微管蛋白类似物。细胞分裂时，在 GTP 存在下，FtsZ 在细胞内膜中心聚合成多聚体，形成高度螺旋结构 Z 环[3-4]。 之后，在其他分裂蛋白的参与下，使 Z 环逐渐缩 小导致隔膜形成，最终导致细胞分裂。FtsZ 在包括结核分枝杆菌在内的原核细胞分裂过程中都发 挥着重要的作用，并且几乎所有原核细胞的 FtsZ 都是高度保守的，因此，以 FtsZ 为靶点的药物能 够抑制多种病原微生物。同时，原核细胞的 FtsZ 与 真核生物的同种功能蛋白之间有较大差异，因基金项目：国家自然科学基金作者单位：100050 北京，中国医学科学院药物研究所天然药物活性物 质与功能国家重点实验室（林媛、蒋建东）；中国医学科学院医药生物 技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室（朱宁屿、司书毅） 通信作者：司书毅，Email：mailto:sisyimb@sisyimb@收稿日期：2014-09-02110中国医药生物技术 2015 年 4 月第 10 卷第 2 期Chin Med Biotechnol, April 2015, Vol. 10, No. 2的耻垢分枝杆菌 Mycobacterium smegmatis mc2155作为体外筛选的模式菌（结核分枝杆菌 H37Rv 与 耻垢分枝杆菌 Mycobacterium smegmatis mc2155 的 FtsZ 蛋白相似性达 95%），对化合物库 2 万个 样品进行初步筛选。筛选方法如下：耻垢分枝杆菌 用 7H9 培养基（含 10% ADC 增菌液）培养，接 种于 9