海兔素改善大鼠酒精性肝损伤的效果及其机制研究Aplysin improve alcoholic liver injury in rats and its mechanism of effect.pdf

摘要 目的：海兔素是一种溴代倍半萜，主要来源于红藻凹项藻属海藻以及海兔中，具有 抑菌、抗炎、抗肿瘤、免疫增强、抗氧化等生物学活性，对酒精暴露大鼠亦具有一 定的肝脏保护作用。本研究通过探讨海兔素对酒精暴露大鼠肝脏乙醇代谢酶、抗氧 化能力、DNA损伤与修复、肝细胞凋亡、氧化／硝化应激、线粒体功能以及内源性 凋亡信号通路等的影响，以此阐明海兔素保肝效果及其可能作用机制。 方法： 重随机分为5组，每组20只。酒精模型组以50％酒精8 予海兔素50、100、150 mg·kg-10d。1灌胃；正常组以等体积牛理盐水灌胃，持续6w。 末次灌胃12h后，大鼠称重后给予7％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，剥取肝组织， 分离红细胞膜，提取肝细胞线粒体及微粒体，并计算肝指数。 2．肝脏病理学检查：H—E染色观察肝脏组织的病理学改变，透射电镜观察大鼠肝细 胞超微结构变化。 3．肝功能及脂质代谢水平评价：用赖氏法检测血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨 清中TC含量；GPO—PAP法测定血清及肝脏TG含量。 4．硝化应激程度的评价：用化学比色法检测血清中一氧化氮合酶(NOS)活性；硝 酸还原法测定血清中一氧化氮(NO)含量；采用Western blotting检测大鼠肝脏中 iNOS蛋白表达水平的变化。 5．肝脏乙醇代谢酶活性的测定：制备10％肝组织匀浆，应用比色法检测肝脏乙醇脱 氢酶(ADH)的活性；差速离心结合钙沉淀法制备微粒体，硝基酚法检测肝微粒体细 胞色素P450亚酶2El活性。 6．DNA氧化损伤程度的评价：采用原位两步Ⅳ型胶原酶灌注消化分离肝细胞，制 各大鼠肝细胞悬液，通过彗星实验(单细胞凝胶电泳实验)测定肝细胞DNA损伤程度； 程度。 7．抗氧化综合能力的分析：酶法测定肝脏胞浆乳酸／丙酮酸比值，反映NAD+／NADH 比值；利用低渗一步溶血法和红细胞膜荧光标记法检测红细胞膜流动性；微板法检 测血浆中脂质过氧化物(LPO)的水平；硫代巴比妥酸法(TBA法)测定肝脏和血浆中丙 测定肝脏过氧化氢(CAT)的活性。 8．线粒体功能评价：差速离心法制备线粒体，测定线粒体悬液中Mn—SOD的活性和 GSH含量；比色法测定线粒体呼吸酶链复合物(MRC)活性。 9．肝细胞凋亡的评估：采用AnnexinV-FITC／PI双染法检测肝细胞凋亡情况。 亡通路关键蛋白(Bcl一2、Bax、细胞色素C、caspase一3)的变化。 组织中CYP2E1 caspase一9、caspase-3)的mRNA表达水平。 结果： 1．海兔素改善酒精性肝损伤的效果评价 与正常对照组相比，酒精模型组大鼠周体重有轻微下降，肝指数明显增加(P 0．05)；与酒精模型组相比，各剂量海兔素干预组大鼠周体重均有所提高，但海兔素 中、高剂量组大鼠肝指数均显著降低(P0．05)。HE染色病理观察结果显示，海兔 素各剂量组肝脏脂肪变性明显得到改善，炎性细胞浸润减少，与酒精模型组相比较， 中、高剂量海兔素干预组，肝索排列逐渐恢复整齐，组织结构趋向正常。透射电镜 下观察发现，各剂量海兔素组胞浆脂滴数量减少，线粒体病变明显减轻且数目有所 增加，粗面内质网退化与排列紊乱程度有所改善。在本研究中，酒精模型组大鼠血 的血清ALT、AST和ALP的活性升高。此外，长期大量酒精灌胃能使大鼠体内脂质 代谢紊乱，血清TC、TG以及肝脏TG水平升高，而海兔素干预抑制了酒精摄入引 起的这些变化，同时表现出良好的血脂调节作用。 2．海兔素对酒精暴露大鼠硝化应激和肝脏酒精代谢酶的影响 与正常组比较，酒精模型组大鼠血清TNOS和iNOS的活性明显增加，NO含量 兔素组和酒精模型组相比，血清TNOS、iNOS活性以及NO含量均有不同程度地降 低，且成剂量依赖关系，但ADH和CYP2E1活性仪150 mg／kg海兔素组同时抑制了 它们活性的变化。此外，中、高剂量海兔素可明显抑制大鼠肝组织中iNOS的蛋白 表达。 3．海兔素对酒精暴露大鼠肝脏氧化损伤及氧化应激的影响 酒精模型组胞浆NAD+／NADH比值、红细胞膜流动性均较正常对照组显著降低 细胞膜流动性，尤其是100和150 mg／kg剂量组。海兔素干预后可以明显缓解因酒 精诱导的血浆8．OH