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李氏杆菌活载体疫苗研究进展＊ 李　乐1，苗海生2，李华春1 (1.云南省畜牧兽医研究所，云南昆明 650224；2.云南农业大学动物科技学院，云南昆明 650201)? 摘　要：李氏杆菌活载体疫苗是指把弱毒化李氏杆菌改造为外源性抗原载体，活的李氏杆菌携带外源性抗原进入机体细胞内，通过MHCⅠ和MHCⅡ系统呈递外源性抗原，使机体产生针对外源性抗原的免疫保护，这是一种新型的疫苗系统。李氏杆菌的细胞内寄生和黏膜感染的特性，使得李氏杆菌活载体疫苗系统具有很多优势，该疫苗具有同时使机体产生细胞免疫和黏膜免疫的特性。近年来，通过毒力基因的重组对李氏杆菌进行的弱毒化改造，已经获得了一些有价值的安全载体菌株，如ACTA和plcB毒力基因双重删除毒株等，使李氏杆菌活载体疫苗在安全性方面更有保障。在艾滋病疫苗研制中，携带gag基因的李氏杆菌活载体疫苗可以使小鼠抵抗重组表达的HIV-1 gag的痘病毒对系统和黏膜的攻击，李氏杆菌活载体癌症疫苗已经可以使小鼠产生对肾肿瘤和直肠肿瘤的抗性。李氏杆菌活载体疫苗的发展和应用有可能为一些困难疾病的免疫预防带来曙光。 关键词：李氏杆菌；活载体疫苗；细胞免疫 目前，一些病毒、肿瘤和细胞内感染的病原体用常规的疫苗进行免疫预防效果不理想，主要是因为这些疫苗不能有效的刺激机体产生足够的可激发抗原呈递功能和诱导Th1类型细胞免疫的细胞因子，这些细胞因子产生的功能在机体的整个免疫中有非常重要的作用。另外，常规疫苗对一些病毒性疫病很难产生有效的免疫保护，也可能同其不能产生有效的黏膜免疫有关。许多病毒感染发生在黏膜表面，在急性感染过程中，病毒在黏膜表面复制，产生的病毒很快消耗了CD4＋ T细胞，于是产生了体内传播。如果宿主有足量黏膜免疫，那么它对整个机体的免疫保护将起非常重要的作用[1]。近年来，随着分子生物学技术的发展，涌现出了一批根据一些特殊微生物的特性组装成的新疫苗，这种嵌合疫苗可以刺激机体产生细胞免疫和黏膜免疫，利用产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes，LM)的细胞内寄生特性设计的活载体疫苗便是其中一例。LM是一种专营细胞内寄生的革兰氏阳性细菌，它可以逃避宿主细胞的吞噬溶酶体进入细胞质内繁殖，诱导Th1类型的细胞因子使机体产生细胞免疫，LM的自然感染路线主要是通过口腔黏膜进行感染，因此可使机体产生黏膜免疫。把LM进行改造，消除毒性，使其成为携带外源性基因的细菌，也就是活载体疫苗。免疫动物后，该菌可在机体内进行外源目的基因的表达和分泌，使机体能产生针对外源性抗原的细胞免疫和黏膜免疫。LM活载体疫苗在某些困难疾病的免疫方面具有很大的应用价值。本文对LM活载体的构建和试验方面的研究进展，以及LM作为一种高效的外源性蛋白载体在诱导机体产生细胞免疫应答方面取得的成就做一综述。 1　李氏杆菌的特性和改造方案 LM是革兰氏阳性细菌，属于硬壁菌门，各型广泛存在于自然界中。研究发现其对37个哺乳动物品种，大多数有不同程度的致病性，能引起败血病、脑膜炎、脑炎等。如果感染子宫或子宫颈，还可以引起流产。LM可以在噬菌细胞内生活，可以进入脑内，还可以通过胎盘传给胎儿。LM的病理特性与LM能在噬菌细胞内生活和繁殖有关[2-3]。 LM最初是通过“拉练”方式入侵非噬菌细胞。首先用listerial internalins(Inl)和宿主细胞黏附因子如E-cadherin和Met结合激活Rho-GTPases，然后通过一系列的反应最终使细胞把细菌吞噬。在细胞内LM通过两个毒力因子，即Isteriolysin-O(LLO - encoded by hly)和Phospholipase-c B (PlcB)的作用逃脱出空泡/吞噬体。在细胞内，LM首先用ActA 蛋白作用于肌动蛋白形成突起，再通过一系列的机制传播到另外的细胞内[2]。 由于LM在细胞内部的繁殖，使细菌分泌的蛋白质能有效的进入到MHCⅠ抗原传递系统内，因此可以刺激机体产生强的细胞免疫[4]。该特性具有重要的使用价值，如果能使LM表达外源性病毒基因并将其注入体内，则机体必将产生对该病毒基因产物的特异性细胞免疫。Saklani-Jusforgues等研究表明，LM载体主要是特异性感应CD8 T淋巴细胞[5]。在LM携带外源基因通过黏膜进入细胞内的过程中，还可使免疫反应发生在黏膜上。因此，LM可以同时产生细胞免疫和黏膜免疫。 由于LM具有较强的毒性，将其用于活载体疫苗时需要对其进行改造，使之成为弱毒，或者使之没有增殖能力但保留免疫能力。目前，对LM的全基因测序已经完成，LM DNA为环状，长2 944 528 bp，有2 853个开发阅读框。LM主要包括9个毒力基因[6]。 随着人们对LM毒力基因研究的不断深入，开始对LM进行改造和筛选，并获