Gateway实验方案.docVIP

Gateway实验方案 TOPO? TA 克隆 - 创建 Gateway? 入门克隆 步骤一 – 制备 PCR 产物使用 Taq 聚合酶和自己的方案生成 PCR 产物。 通过最后 7 到 30 分钟的延伸步骤，结束 PCR 反应。步骤二 - 进行 TOPO? 克隆反应 ??? ?? 1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种 TOPO? 克隆????? 反应。 对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释????? 盐溶液。 试剂 化学转染 电穿孔法 新鲜的 PCR 产物 0.5 至 4 μl 0.5 至 4 μl 盐溶液 1 μl -- 稀释盐溶液 -- 1 μl 无菌水 至终体积为 5 μl 至终体积为 5 μl TOPO? 载体 1 μl 1 μl 总体积 6 μl 6 μl ?? 2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。?? 3. 置于冰上，然后开始转化 One Shot? 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三 - 转化 One Shot? 化学感受态 E. coli ?? ??? 1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶 One Shot? E. coli 细胞。?? 2. 在一小瓶 One Shot? 化学感受态 E. coli 中加入 2 μl TOPO? 克隆反应液，????? 轻轻混匀。?? 3. 在冰上孵育 5 至 30 分钟。?? 4. 将细胞置于 42°C 下热休克 30 秒，不振荡。 立即????? 将试管转移至冰上。?? 5. 加入 250 μl 室温 S.O.C. 培养基。?? 6. 在 37°C 下振荡孵育 1 小时。?? 7. 在预热的 LB 琼脂平板上涂布 10-50 μl 细菌培养物（琼脂平板含有????? 100 μg/ml 大观霉素），并于 37°C 下过夜孵育。 Gateway? 反应的基础知识 BP 反应从含有 attB 侧翼序列的 PCR 产物到生成 Gateway? 入门克隆只需 1 小时的简单反应。 参见下文的实验设置概述。 更多详细信息，请参阅说明书。 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：attB-PCR 产物（=10 ng/μl；最终量 ~15-150 ng）1-7 μl供体载体 (150 ng/μl) 1 μl TE 缓冲液，pH 8.0 补充至 8 μl 将 BP Clonase? II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。 对 BP Clonase? II 酶混合物稍微震荡两次（每次 2 秒）。 对于每份样品（上述步骤 1），向反应液中加入 2 μl BP Clonase? II 酶混合物，稍微震荡两次以充分混匀。 进行短暂的低速离心。 将 BP Clonase? II 酶混合物放回 -20°C 或 -80°C 储存。 反应体系 25°C 孵育 1 小时。 向每份样品中加入 1 μl 蛋白酶 K 溶液来终止反应。 稍微震荡。 在 37°C 下孵育样品 10 分钟。 转化 取 1 μl 的各 LR 反应液转化 50 μl One Shot? OmniMAX ? 2 T1 噬菌体抗性细胞（目录号 C8540-03). 冰上孵育 30 分钟。 通过 30 秒的 42°C 孵育对细胞进行热休克。 加入 250 μl S.O.C. 培养基并在 37°C 震荡孵育 1 小时。 将 20 μl 和 100 μl 每种转化液分别涂布于选择性平板上。 注意： 任何转化率达 1.0 × 10 8 转化子/μg 的感受态细胞均可以使用。 取 1 μl pUC19 DNA (10 ng/ml) 转化 50 μl 上述 One Shot ? OmniMAX? 2 T1 噬菌体抗性细胞。 在含 100 μg/ml 卡那霉素或含供体载体的相应选择性标记物的 LB 平板上涂布 20 μl 和 100 μl。 预期结果如果转化并涂布全部 BP 反应液，则高效的 BP 重组反应将产生 1500 个以上的菌落。? LR 反应将基因从 Gateway? 入门克隆转移至目的载体只需 1 小时的简单反应。 参见下文的实验设置概述。 更多详细信息，请参阅说明书。 在室温下向 1.5 ml 管中加入下述组分并混匀：入门克隆 (50-150 ng) 1-7 μl目的载体 (150 ng/μl) 1 μlTE 缓冲液，pH 8.0 补充至 8 μl 将 LR Clonase? II 酶混合物置于冰上约 2 分钟解冻。 对 LR Clonase? II 酶混合物进行两次短暂的漩涡震荡（每次 2 秒）。 对于每份样品（上述步骤 1），向反应液中加入 2 μl LR Clonase ?II 酶混