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细胞生物学专业优秀论文 华南地区中间型β地中海贫血的分子基础：遗传异质性和表型多样性 关键词：β地中海贫血 遗传表型 遗传异质性 修饰因子 β珠蛋白基因型 摘要：背景与目的： 本研究立足于地贫的高发区收集中间型β地中海贫血样本，系统分析来自华南地区的117例中间型β地贫患者的分子基础，研究靶点包括β珠蛋白基因型，α珠蛋白基因型和其他影响α/β珠蛋白基因比例的一些遗传修饰因素。本研究拟通过对中间型β地贫患者的临床资料，血液学资料和分子基础进行综合分析，阐明华南地区的中间型β地贫的分子基础，为临床实践提供必要的支持。 病例样本与方法： 1.病例样本及表型分析： 纳入本研究的样本来自地中海贫血高发区（主要是广西省和广东省）的109个家系，共117例中间型β地贫患者（纳入标准：Hb含量在60～105 g/L；MCVamp;lt;80 fL； MCHamp;lt;27 pg；在幼儿期间可以不依赖输血而能够存活；发病年龄在2岁以后）。统计样本的输血情况，首次发病时的年龄，肝脾是否肿大，有无进行脾切除手术，有无地贫面容等。采集117例样本的EDTA抗凝外周静脉血。 2.实验方法： （1）对117例样本进行如下分析：①进行血常规和血红蛋白含量分析，提取所有样本的DNA，-20℃低温保存备用。②对α、β珠蛋白基因的突变进行分析：利用反向点杂交技术（reverse dot blot，RDB）对中国人群中常见的α、β珠蛋白基因点突变或小的缺失或插入突变进行分析；利用Gap-PCR技术分析中国常见的珠蛋白基因缺失突变（3种常见的α珠蛋白基因缺失突变，包括-α3.7、-α4.2和——SEA。2种β珠蛋白基因簇缺失，包括东南亚型遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征（SEA-HPHF）缺失和中国型Gγ+（Aγδβ）0缺失）；利用PCR技术对αααanti3.7和αααanti4.2这两种α珠蛋白基因的三联体进行分析。③利用基于PCR基础上的Xmn1酶切技术，分析Gγ珠蛋白基因的-158位的Xmn1酶切位点。经过上述分析，117例样本可以分为两类，一类是基因型可以解释表型的样本；一类是基因型尚不能解释表型的样本（β0/β0，β+/βN或β0/βN） （2）对基因型为β0/β0，β+/βN或β0/βN的样本进一步分析。针对前者，PCR扩增α2和α1珠蛋白基因全长，对PCR产物直接测序。采用基于PCR基础上的直接测序技术进一步对多个可使HbF水平升高的遗传修饰因素进行分析，这些因素包括：3amp;#39;HS1，5amp;#39;HS2核心区，Gγ和Aγ珠蛋白基因的启动子区，β珠蛋白基因-540区的（AT）x（T）y序列，BCL11A基因中rSNP位点信息。针对后者，对以下多个位点进行了分析：β珠蛋白基因全长，5’HS2和5amp;#39;HS3的核心区，AHSP基因全长，以及GATA-1和HRI的cDNA序列。对部分样本5’HS2核心区的PCR产物通过克隆测序进一步验证。 （3）对本课题中可能发现的新突变进行分析：①评价新突变对β珠蛋白基因表达水平的影响②利用基于PCR的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术对β珠蛋白基因簇进行单倍型分析。 （4）利用半变性高效液相色谱（DHPLC）技术分析新突变和BCL11A基因的SNP位点r对照样本中的情况。 （5）统计分析：采用统计软件SPSS13.0。主要是利用两独立样本的t检验方法分析突变对β珠蛋白基因mRNA水平的影响。 结果与讨论： 本研究我们共收集到117例中间型β地贫样本。年龄介于2岁和60岁，发病年龄则处于1.5岁和27岁。75例有地贫面容，29例尚未出现地贫面容。62例没有输过血，15例输血1次，31例需要偶尔输血。69例患者存在肝脾肿大，其中实行脾切除手术的患者有23例，36例尚未出现肝脾肿大。可见，这些中间型β地贫患者的表型差别很大，即具有很大的表型异质性。 本课题在117例中间型β地贫患者中共检测到18种β珠蛋白基因突变，这些突变的出现频率明显不同，它们的出现频率从大到小的顺序排列如下：一28（A→G），CD41-42（-CTTT），CD17（A→T），βE（CD26 G→A），IVS-2-654（C→T），IVS-2-5（G→C），CD71-72（+A），SEA-HPFH，IVS-1-1（G→T）和-29（A→G），中国型Gγ+（Aγδβ）0，CD43（G→T），-73（A→T）、CD15-16（+G）、CD27-28（+C）、CD53（-T）、Cap+39（C→T）和Term CD+32（A→C）等6种突变各1例，最后两种突变是在