乔实验报告1.pptVIP

实验报告;一、研究内容;基因；序列长度；蛋白分子质量；酶的种类;;二、实验方法;1、目的基因的克隆;（1）calkro目的细菌的液体培养 培养基CALDICELLULOSIRUPTOR MEDIUM.640 DSMZ 加有培养基的培养瓶用真空泵抽出氧气冲入氮气 70摄氏度油浴，？转 2天 （2）基因组DNA的提取 天根试剂盒 （3）pcr获得目的基因 ;;;;引物设计;除2385外全是以上的方法 2385引物设计方法为加酶切位点及保护碱基（ndeⅠ/xhoⅠ）;2、基因工程菌的构建及阳性转化子的鉴定;（1）载体的筛选 pet28B 酶切位点ndeⅠ/xhoⅠ、NheⅠ/HindⅢ 带有组氨酸标签，及酶切位点不远处有终止密码子 kana抗性基因 （2）重组载体的构建 ①质粒pet28b ndeⅠ/xhoⅠ双酶切 T4连接酶与酶切过的2385连接 ②T4聚合酶处理用NheⅠ/HindⅢ酶切过的pet28b 与T4聚合酶处理过的目的基因连接15min 22℃ ;;（3）重组载体的转化及阳行转化子的筛选与鉴定;3、诱导表达及鉴定;（1）重组质粒的提取 质粒小提试剂盒 （2）重组质粒转换到表达菌BL21 转化 1、1ul加入到100ul BL21感受态中 冰浴30min 2 42度水浴1min 3 加入500ul LB 37度 1h 4 吸取100ul，涂布LB KANA 平板 37度过夜 ;（3）表达菌的诱导与目的蛋白鉴定 1、每个板挑3-5个菌落到2ml的LB 卡那 培养基中37度摇菌 2、5-6h后转接到100mlLB kana培养基中37度200r到0d600=0.6 培养基转移到冰上，加入0.1mM IPTG（13ul 0.8mM的IPTG） 3、16度160r摇菌过夜 4、4度离心10min 4000xg 5、用2ml binding buffer重悬，冰上操作，超声破碎 6、10000r离心15min 上清和沉淀分开 冰上进行 上清65℃水浴30min 10000r，4℃离心15min 吸出上清 7、Ni-IDA用binding buffer预处理1：10.即600ulNi-IDA用6ml binding buffer洗涤 8、65度上清加入柱子，混匀1h 9、6ml binding buffer洗柱子，去除杂蛋白 10、2ml 150mM咪唑elushion buffer洗脱 Sds电泳 ;蛋白鉴定 分子量大小对比；酶活测定;4、酶学性质研究;三、实验结果;2、目的菌基因的获得;;3阳性转化子的鉴定结果;157;1-2为0578 ；3-7为0579；10-11为0580；12-13为2383;4、目的蛋白的鉴定157 59KDa;;;1 BL21 ，2 BL21 IPTG诱导，2、全菌未诱导，3、全菌诱导，4、超声上清，5、全菌超声沉淀，6、55度上清，7、65度沉淀，8、穿透夜，9??10咪唑洗脱液（10ul、20ul） 0579 49kda;1 BL21 ，2 BL21 IPTG诱导，2、全菌未诱导，3、全菌诱导，4、超声上清，5、全菌超声沉淀，6、55度上清，7、65度沉淀，8、穿透夜，9、10咪唑洗脱液（10ul、20ul） 0580 蛋白分子量 76kda;1BL21 IPTG诱导，2、全菌未诱导，3、全菌诱导，4、5超声上清，6、7全菌超声沉淀，8、9 55度上清，10、65度沉淀，11、穿透夜，12、13咪唑洗脱液（10ul、20ul） 2383 55.6KDa;1 BL21 ，2 BL21 IPTG诱导，2、全菌未诱导，3、全菌诱导，4、超声上清，5、全菌超声沉淀，6、55度上清，7、65度沉淀，8、穿透夜，9、10咪唑洗脱液（10ul、20ul） 2387 80.6kda;酶活测定