GUS组织化学染色.doc

GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。2． 实验材料1）??转基因烟草叶片或试管苗2）??非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3． 药品试剂1)??X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100μL，保存于-20。2)??底物溶液（染色液）：3)??1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-1004． 实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37），微量移液器5． 实验步骤1)??将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2)??37培养箱中温育1小时至过夜；3)??将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。6． 结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。 先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRITION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML /plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%20for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf/stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalStaining.pdfhttp://dps.plants.ox.ac.uk/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.pdf Gus staining 1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassiumphosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g ---200mlKH2PO4: 27.2g----200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4---- 300ml 1M potassium phosphate buffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide 82mg0.5mM Potassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use.Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2 共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*） 0.2　mol/L　Na3PO4缓冲液(62　mL　0.2　mol/L　Na2HPO4;38　mL　0.2　mol/L　NaH2PO4)，pH　7.0； 0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc. 1000ml x-gluc 10