第七章 抗生素微生物检定法.pptVIP

第七章 抗生素微生物检定法无菌检查法 第一部分 抗生素微生物检定法 第二部分 无菌检查法 第一节 抗生素微生物检定法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 依试验设计原理不同，分为稀释法、比浊法、 琼脂扩散法。 中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。 管碟琼脂扩散法 抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试 验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现 透明的抑菌圈。 该法根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂 量与抑菌圈的直径或面积呈线性关系，通过比较 标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试 品的效价。 操作要点： 1、常用菌种：枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌 、金黄色葡萄球菌 、藤黄微球菌 、大肠杆菌 。 菌种不同，培养要求条件也不一样。 2、培养基及其制备方法 培养基配方： 胨 5 g 磷酸氢二钾 3 g 牛肉浸出粉 3 g 琼 脂 15-20 g 蒸馏水 1000 ml 混合上述成分，调节pH 比最终要求的略高0.2-0.4,加入琼脂，加热融化后，过滤，分装、灭菌。 3、标准品溶液的制备 按标准品说明书进行，在同一条件下称量标准品与供试品。 4、供试品溶液的制备 按药典规定的方法称量，溶解后，再按估计的效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度。用容量瓶稀释药品，不得超过3步， 每次取样量不得少于2 ml。 5、双碟的制备： 取直径90 mm，高16-17 mm的平底双碟，加入融化的 培养基20 ml，使在碟底内均匀摊布，放置在水平台上使 其凝固，作为底层。 另取培养基适量（5 ml），加热融化后，放冷至40- 50℃，假如规定的细菌悬液适量（能得到清晰的抑菌圈 为度），此为含菌培养基（菌层）。放置在水平台上使 其冷却，然后在每一双碟中以等距离均匀安置不锈钢 管，钢管内径为6 mm，高10 mm，外径7.8 mm。二剂量法 用4个，三剂量法用6个，用用陶瓦盖覆盖，留置5-10分 钟。 6、检定法 （1）二剂量法 取双碟四个，在每个双碟内对角线2个不锈钢管中分别滴加高浓度及浓度的标准液，其余两个不锈钢管中分别滴加高浓度及低浓度的供试品溶液。高、低浓度的剂距比为2：1或4：1。35-37℃ 培养14-16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。滴加抗生素溶液：滴加溶液至钢管口平满，滴加溶液间隔时间不可过长 。 （2）三剂量法 取双碟六个，在每个双碟内间隔的3个不锈钢管中分别滴加高、中及低浓度的标准液，其余两个不锈钢管中分别滴加高、中及低浓度的供试品溶液。三个浓度的剂距比为1：0.8。35-37℃ 培养14-16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。 7、结果判定 实验计算所得效价低于估计效价的90%或高 于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试， 应调整供试品估计效价，予以重试。 第二节 无菌检查法 是检查药品与辅料是否污染活菌的一种 方法。 无菌检查的操作环境和全部过程应严格 遵守无菌操作，防止微生物污染，同时应避 免在有菌条件下操作。 无菌检查法 1、菌种 需气菌与厌气菌 藤黄微球菌、生孢梭菌。 霉菌：白色念珠菌。 2、培养基 按规定的组方制备、配制后应采用合格的灭菌程序灭菌(121 ℃,30 mins)。制备好的培养基应保存在2-25℃，避光的环境中。 培养基若保存在非密闭的环境中，一般应在3周内使用。 若保存在密闭的环境中，一般可在一年内使用。 培养基无菌检查：每批培养基随机取不少于5支 （瓶），培养14天，应无菌生长。 临用前培养基分别经30-35℃（用于细菌培养的培养 基）和20-25℃（用于霉菌培养的培养基）培养不少于 48h和72h。 常用的培养基： ①硫乙醇酸盐流体培养基 30-35℃，用于培养好氧菌、厌氧菌。 ② 改良马丁培养基 23-28℃条件下培养，用于培养真菌。 ③ 营养肉汤培养基 蛋白胨+牛肉浸出粉+氯化钠，灭菌。 ④ 营养琼脂培养基 营养肉汤培养基中加入琼脂，灭菌 无菌检查法 3、随机抽取2份样品，无菌接种后， 分别在30-35℃和20-25℃培养7日。 4、结果判定： 无菌生长为符合规定。 * * * * *