单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株的筛选 Screening of Listeria Monocytogenes Mutants on Biofilm Formation.pdfVIP

第9卷第2期 中国食品学报 V01．9No．2 2009年4月 JournalofChineseInstituteofFoodScienceand 009 Technology Apr．2 单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株的筛选 马瑜丹1 朱欣娜1 龙 飞- 史贤明1,2 (1上海交通大学农业与生物学院食品科学系陆伯勋食品安全研究中心 上海200240 2上海食品安全工程技术研究中心 上海201203) 摘要通过对功能和调控基因的研究，探讨单核细胞增生李斯特茵茵膜的形成机制．建立防治该细茵污染食品 的方法。使用电转化的方法，将携带转座子Tn917的质粒pTVI—OK转化到单核细胞增生李斯特茵中．诱导转 座，获得l880个突变株，加上前期构建的突变株，使突变库增加到2200株。使用96孔细胞培养板对随机挑选 的1000余株突变株进行茵膜培养，结晶紫染色后测‰值。以此值作为茵膜形成量的筛选依据。最终挑选出 茼膜形成能力变小的突变株8株，目标突变获得率约8％0。对筛选的茵膜形成量变小的突变株进行荧光显微观 察，证实该8株突变株茵膜形成能力弱于野生茵株。通过PCR验证，这8株突变株的基因组中插入了Tn917．这 可能是它们的表型发生变化的原因。 关键词 单核细胞增生李斯特茵Tn917茵膜 文章编号1009—7848(2009)02-001l_0r7 菌膜是细菌在自然界存在的一种重要方式【ll。 的与细菌菌膜形成相关的基因主要有编码胞外多 细菌附着于固体表面或气液交界面，粘连形成膜 糖、细胞运动能力相关蛋白等的基因及其调控因 状结构，并形成具有强大生存能力的群落，使细菌 子．如表皮葡萄球菌的／ca操纵子161．肠球菌表面蛋 对抗生素、消毒剂以及免疫系统等的抵抗力较游 白esp基因171；编码细胞间群体感应信号分子的基 离状态强121。单核细胞增生李斯特菌是目前世界公 因，如变形链球菌com基因(群体感应信号系统)嘲， 认的四大食源性致病菌之一。因其强致病性和高 v／cRK基因(vicRK信号传导系统)唧。依赖于酰基 死亡率131而成为食品安全的关注对象。单核细胞增 丝氨酸内酯或缩氨酸的菌种内群体感应的luxS 生李斯特菌能在多数固体表面形成菌膜141．菌膜状 基因【lq等。目前对单核细胞增生李斯特菌菌膜形 态的单核细胞增生李斯特菌有更强的抗逆性．这 成相关基因的研究主要是验证一些已知功能基因 就使常规的杀菌方法难以对其有效杀菌．从而导 在其菌膜形成中的作用．如luxS基因【--一-2】和agrB． 致食品污染151。同时，单核细胞增生李斯特菌菌膜 DCA操纵子i131。 还可能是其它致病菌及腐败微生物的藏身之地． 单核细胞增生李斯特菌是革兰氏阳性的短小 细菌间的群落互感效应使得多种细菌能够协同共 杆菌，在构建突变时．可以使用在革兰氏阳性菌中 生，从而增加了食品加工环境以及食品本身被污 自主复制的温敏型质粒pTVl一OK。常见的质粒转 染或再污染的风险，甚至引起食物中毒。 化方法有原生质体转化法和电转化法等。陈永辉11田 细菌菌膜的形成受基因的调控。目前已确定 采用的原生质体转化法构建突变株库，操作步骤 较为繁琐。本文为达到较好的扩充突变株库的目 的．使用电转化的方法获得转化子，再诱导阳性转 收稿日期：2008-04—27 化子携带的转座子Tn917转座．达到阻断基因的 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划课题(2006BAK02 目的。期望通过